糖链（glycan）被认为是“生命的第三条链”。几乎所有真核细胞表面均覆盖着一层糖萼，其在细胞识别、信号转导和免疫调控等过程中发挥关键作用。然而，受限于糖链非模板驱动合成、结构高度异质性以及质谱离子化效率较低等因素，糖组学（glycomics）分析长期面临灵敏度不足、样品处理流程复杂以及低丰度样品难以检测等问题。尤其对于痕量样本，传统糖组学方法往往需要微克蛋白水平起始量或个性化的仪器平台，严重限制了糖组学在基础研究与临床转化中的广泛应用。

近日，上海交通大学药学院魏娟课题组联合上海交通大学医学院附属第九人民医院李斌团队，在Nature Communications发表题为：High-sensitive glycomics using seGRAP-mass spectrometry uncovers a conserved N-glycome in single human oocytes的研究论文。该论文入选Nature Communications Editor’s Highlights文章，并被收录于“Structural biology, biochemistry and biophysics”专题页面。研究团队开发了一种超高灵敏、简便易用的N-糖组分析新方法seGRAP（solution-enhanced Glycan Reduction and Permethylation）。该方法创新性地将糖链还原、除盐、泛甲基化及富集等步骤进行一站式集成，并重新设计优化了还原糖链与泛甲基化糖链的纯化富集体系。seGRAP方法不仅实现了低损耗、高效率的糖链样品前处理，大幅简化了操作流程，同时使得在常规质谱平台上即可完成纳克级蛋白的N-糖组分析。基于单细胞水平研究，文章首次揭示了人卵在不同个体及发育阶段间高度保守的N-糖组特征，为人类生殖糖生物学及卵子质量评估提供了全新的分子视角。

传统糖组学分析中的还原与泛甲基化流程通常涉及多次萃取、干燥和转移，周期较长且容易造成样品损失，尤其不适用于低起始量样本。针对这一问题，团队创新性地利用加热DMSO直接在多孔石墨化碳（PGC）SPE小柱上洗脱还原糖链，实现了还原与泛甲基化反应的无缝衔接。这一设计不仅免除了传统的酸中和与干燥步骤，还显著提升了高唾液酸化糖链的回收率。同时，团队采用乙酸乙酯替代传统乙腈体系洗脱泛甲基化糖链，大幅提高了复杂糖链的检测灵敏度。制备的糖链可直接兼容MALDI-MS和RPLC-MS等常规质谱平台。与传统方法相比，seGRAP策略实现了检测灵敏度1至2个数量级的跨越式提升，并将全流程耗时压缩至1.5小时以内。依托该优化策略，研究团队在常规nanoRPLC-MS平台上，首次实现了对25 pg RNase B及2 pL人血浆等极低起始量样本的N-糖组分析。

图1 seGRAP（solution-enhanced Glycan Reduction and Permethylation）流程示意图

团队成功将seGRAP应用于人卵单细胞糖组学研究。结果显示，单个卵母细胞中可稳定检出46种N-糖型，且多为含岩藻糖和唾液酸的复杂型糖链，其中包含多个与精卵识别密切相关的sialyl-Lewis X（SLeX）结构。通过对来自12位受试者、涵盖GV、MⅠ和MⅡ三个发育阶段的27枚人卵母细胞进行系统的N-糖组分析，研究发现不同个体及不同发育阶段的人卵母细胞N-糖组均表现出极高的一致性，呈现出显著的糖组保守性。这表明人卵细胞可能存在高度稳定的糖基化稳态机制，以确保受精及早期发育过程的可靠性。

图2单细胞水平的不同个体及发育阶段人卵细胞N-糖组分析。a样本信息。b–d同一供体、同一发育阶段卵母细胞（GV、MⅠ、MⅡ）的N-糖组相关性分析。e同一供体不同发育阶段卵母细胞间的糖组相关性。f不同供体、同一发育阶段（GV）卵母细胞间的N-糖组相关性分析。g来自12位供体的27枚卵母细胞（9 GV、9 MⅠ、9 MⅡ）的两两Pearson相关性分析，右上角为不同发育阶段间的Mantel相关性分析结果。

该研究建立了一套适用于痕量样本的高灵敏、高通量、普适性强的糖组学分析新方法。借助该技术，研究团队首次在单细胞水平上揭示了人卵N-糖组的保守特征，不仅为生殖发育与辅助生殖研究提供了新方向，也为单细胞多组学及精准医学研究提供了坚实的技术与理论支撑。

本论文的第一作者为上海交通大学药学院博士研究生乃皮赛·吐逊买买提。研究得到了国家自然科学基金、细胞工程及抗体药物教育部工程研究中心，上海市药物靶标发现及递送前沿科学研究基地和上海市创新靶标抗体偶联药物重点实验室的支持。