近日，清华大学医学院饶子和教授、娄智勇教授团队与广州实验室、上海科技大学等单位合作，在新冠病毒中发现了一种生物界中全新的RNA加帽途径，阐明核苷类抗病毒药物抑制该过程的分子机制，并提出全新的“induce-and-lock”的药物设计机制。这是该团队在病毒转录复制机制的研究中，继在2020年、2021年在《科学》（Science）、《细胞》（Cell）期刊上连续发表五项相关成果后的又一重要的系统性工作。

“帽”（Cap）结构是细胞中广泛存在的一种RNA修饰。细胞中的一系列酶分子，通过复杂的催化过程，在RNA 5’端前加入一个G核苷，形成“帽核心”结构（cap core，GpppN），再由甲基转移酶对第一、第二、第三个核苷的不同位置进行甲基化，最终形成Cap0、Cap1、Cap2结构（图1）。在高等生物细胞中，Cap1是最主要的“帽”结构形式。

“帽”结构在细胞生命活动中发挥着关键功能。例如，在高等生物细胞中，“帽”结构可以维持mRNA的稳定性，防止核酸酶对mRNA的破坏，并可通过帽结合蛋白（cap binding protein）参与mRNA与核糖体的识别，调控蛋白质翻译的顺利进行。作为必须在宿主细胞中表现生命活性的病毒而言，在其生命活动中，会通过宿主或病毒自身编码的蛋白质，对病毒mRNA进行加帽，其结构与细胞中的“帽”结构完全相同，除了保证病毒蛋白质的顺利翻译，还可以使宿主将病毒mRNA“误认为”是宿主核酸分子，从而逃逸宿主天然免疫的攻击。

图1. 帽（Cap）结构

病毒是一种相对简单的生命形式，是生命科学研究的重要对象，许多重要的生物学概念和生物技术的发展都离不开对病毒的认识，如RNA聚合酶和逆转录现象的发现、冷冻电镜技术发展、基因治疗载体技术等，都来源于对病毒的研究。新冠病毒是目前已知RNA病毒中基因组最大的一种病毒（约30kb），在其基因组RNA和mRNA的5’端也必须具备Cap1“帽”结构。在病毒学传统认知中，冠状病毒核酸的“加帽过程”通过四步反应过程完成（图2，左侧）：第一步，解旋酶（nsp13）将新生核酸5’端三磷酸末端水解掉一个磷酸基团，生成二磷酸末端；第二步，聚合酶NiRAN结构域在二磷酸末端上加入一个GMP分子，生成帽核心结构（GpppA）；第三步，nsp14蛋白的N7甲基转移酶结构域进行第一步甲基化，形成Cap0结构（^7MeGpppA）；第四步，nsp16蛋白的进行第二步甲基化，形成成熟的Cap1结构（7MeGpppA2’-OMe）。其中，聚合酶NiRAN结构域在第二步反应的核心功能，以及nsp14蛋白催化第三步反应的结构基础，是研究团队在2020年和2021年在《细胞》期刊上连续发表两篇论文揭示的。

图2. 新冠病毒RNA加帽的传统机制（左侧）和本工作发现的新机制（右侧）

围绕新冠病毒转录复制过程，研究团队自新冠疫情发生后开展了系统研究，先后阐明了“核心转录复制复合体”（C-RTC）、“延伸转录复制复合体”（E-RTC）、“加帽中间态转录复制复合体”和“Cap0转录复制复合体”的工作机制。在此基础上，研究团队进一步深入探索了新冠病毒核酸加帽的机制，发现新冠病毒能够利用其转录复制复合体中的单链核酸结合蛋白nsp9作为媒介，介导全新的加帽过程（图2，右侧）。

该过程分为两个阶段（图3）。第一阶段，聚合酶NiRAN结构域水解新生核酸链5’三磷酸末端成为单磷酸末端，并将剩余的单磷酸末端与nsp9蛋白N端第一个氨基酸（Asn1）的氨基共价连接，形成RNA-nsp9中间产物，该过程被命名为“RNAylation”过程。第二阶段，聚合酶NiRAN在其“G口袋”中结合一个GTP分子，诱导NiRAN结构域发生构象变化，将一个称之为“断键水分子”的水分子向RNA与nsp9共价键的距离推进至3.8Å，使其发挥亲和攻击能力，导致RNA与nsp9间的共价键断裂，再由断键形成的高能基团攻击GTP，最终形成帽核心结构（GpppA）。这一现象的发现，不仅是对新冠病毒乃至其他病毒生命过程理解的重要更新，而且在生物学领域中也是第一次发现这种由蛋白质作为媒介来介导的RNA加帽过程，拓展了生命科学研究中对核酸加工的认识边界，为在人体细胞中发现可能存在的类似现象提供了一个重要的起点。

图3. 新冠病毒转录复制复合体与RNA-nsp9的复合体结构（上）与加帽新机制（下）

研究团队进一步发现，核苷类抗病毒药物能够被聚合酶NiRAN结构域，通过类似的机制共价连接到nsp9蛋白，进而阻止了加帽反应过程。尤其特殊的是，当核苷类抗病毒药物索非布韦（sofosbuvir）连接到nsp9蛋白后，药物分子结合在一个称之为“Nuc口袋”的位点，并通过其核糖基团上的化学修饰，诱导NiRAN结构的“S-loop”发生剧烈的构象改变，封闭“G口袋”中GTP分子进出的路径（图4）。这一系列发现，不但为认识核苷类抗病毒药物的作用机制提供了全新视角，还为我们展示了一种“induce-and-lock”的全新的药物设计机制，为进一步发展高亲和力、全新的抗病毒药物提供了一个全新的角度。

图4. 索非布韦与S-loop的作用（左）、S-loop封闭G口袋的机制（右）

10月4日，该成果发表在《细胞》(Cell)期刊上，文章名称为“新型冠状病毒RNA加帽过程新机制及核苷类似物对其抑制机制的研究”(A mechanism for SARS-CoV-2 RNA capping and its inhibition by nucleotide analogue inhibitors)。

该成果的获得得益于研究团队在冠状病毒转录复制领域中19年来的长期积累。自2020年，研究团队系统研究了新冠病毒转录复制过程，阐明了关键药物靶点蛋白主蛋白酶Mpro和转录复制复合体多个状态三维结构，为认识病毒的生命过程、发展高效抗病毒药物提供了关键信息，先后在《自然》（Nature）、《科学》（Science）、《细胞》（Cell）上和《自然·通讯》（Nature Communications）上发表系列研究论文，是国际上新冠病毒转录复制研究中最为系统、引用最多的工作之一，被评为“2021年度中国科学十大进展”“2021年度中国生命科学领域十大进展”“中国2021年度医学重要进展”等。

清华大学医学院教授饶子和、娄智勇和上海科技大学博士高岩为共同通讯作者，清华大学医学院博士闫利明、2018级博士生黄羽岑、博士葛基、2019级博士生刘震宇为共同第一作者。