近日，上海交通大学农业与生物学院马晓强团队联合北京工商大学、中国科学院大连化学物理研究所等单位在期刊Nature Communications上发表了题为“A microbial platform for selective biosynthesis of monoterpene esters”的研究论文。该研究构建了一个双底物微生物平台，系统揭示了醇酰基转移酶（Alcohol acyltransferase , AAT）催化三类单萜酯生物合成的规律，并通过结构导向蛋白质工程与共培养策略，实现了单萜酯高选择性、高滴度合成，为酯类化合物绿色生物制造提供了新的路径。

天然酯类广泛存在于花卉、果实、传统发酵食品及药用植物中，是构成果香、花香等特征风味重要物质基础，也在香精香料、食品添加剂、化妆品等领域具有重要应用价值。单萜是风味酯类分子的重要来源之一；其中，单萜酯则广泛分布于玫瑰等芳香植物、酿造食品以及各类酰基化天然产物中。通过代谢工程重构微生物合成途径，实现单萜酯精准合成，不仅契合绿色生物制造发展方向，也有望满足对手性/异构成分定制需求。但如何在微生物体内高效、精准地合成结构复杂单萜酯，始终是该领域面临的重要挑战，其核心瓶颈在 AAT 底物选择性不足、催化产物易混杂，以及单萜醇与酰基辅酶 A 前体供给难以协同匹配。

图1. 双底物微生物平台用于单萜酯生物合成

针对上述挑战，该研究建立了双底物微生物平台，在工程化大肠杆菌中对来自酿造微生物、植物等AAT进行活性谱分析，合成了三类单萜酯：a）单萜醇酯（Monoterpenyl Esters, MTEs）：单萜醇与短链脂肪酸或芳香酸来源的酰基辅酶A 酯化，共获得 64 种； b） 3 种单萜酸酯（Monoterpenoate Esters, MTaEs）：由单萜酸衍生的酰基辅酶A与短链醇酯化； c） 4种单萜醇单萜酸酯（MtMtaEs）：由单萜酸辅酶A与单萜醇酯化生成，含4个异戊二烯单元，为此前研究较少的二聚单萜酯；共获得 71 种单萜酯覆盖理论化学结构空间的61.2%，为迄今最系统的单萜酯生物合成谱图。

然而，在胞内高浓度乙酰辅酶A存在下，多数AAT对>C2酰基辅酶A（如丁酰辅酶A）的选择性仍然不足，导致产物专一性低。为此，基于AlphaFold2预测的草莓来源FaAAT结构开展分子对接与理性工程改造，鉴定到关键活性位点残基F303。单点突变F303G显著改变了酰辅酶A 结合口袋空间构型，将FaAAT对丁酰辅酶A的偏好性大幅提升，配合双底物摩尔比动态调节，实现了丁酸香叶酯合成选择性>99%精准调控。动力学分析揭示FaAAT F303G突变通过重塑反应坐标中的能量学与动力学，偏向主导反应通道；而其同源酶FaAAT2中相应突变（I303G）则通过分散能量网络发挥作用，体现了不同AAT骨架的单残基工程策略机制多样性。该策略普适性得到系统验证：以丙酸香叶酯、丁酸丁酯、丁酸苄酯等为非单萜酯配对体系同样实现高选择性合成，表明单残基工程与双底物比例调控协同策略可广泛适用于多类醇-酰基辅酶A配对的酯类生物合成精准调控。

图2. FaAAT结构导向改造提升>C2酰基辅酶A利用选择性

在前体供应层面，将单萜醇合成模块与酯化模块解耦，构建大肠杆菌-大肠杆菌共培养体系，以单萜醇作为“桥接分子”连通两个代谢模块。在1L发酵罐实现了乙酸芳樟酯11.50 g/L、丁酸香叶酯3.16 g/L滴度合成。天然酯类分子构成了酒类、奶制品等酿造食品风味体系的重要基础，其中乙酸酯、乙酯等短链酯最为常见；相比之下，更高碳链酯类风味分子仍缺乏高效、精准的微生物定向合成技术，具有明显开发潜力。例如，在乙醇大量存在的酿造体系中，如何实现>C2短链醇酯选择性合成，也是酿造食品风味精准调控重要前沿问题。此外，植物基因组中存在数量庞大的BAHD型AAT，广泛参与萜类、芳香族等天然产物酯化组装，但多数对短链酰基辅酶A和醇选择性合成能力尚未得到系统表征与开发利用。以单萜酯为模型，本研究建立的双底物微生物平台，为AAT系统筛选、选择性机制解析和工程改造提供了高效工具，也为酿造风味酯类精准调控和天然酯类产物绿色制造提供了理论支撑。

图3. 大肠杆菌-大肠杆菌共培养实现单萜酯合成及发酵罐验证

上海交大农业与生物学院杨佃琪博士和梁鸿博士为论文共同第一作者，马晓强长聘教轨副教授为通讯作者。北京工商大学孙宝国教授、王柏文副教授及上海交大艾连中教授参与了富含AAT的酿造微生物研究；上海交大肖作兵教授、赵一雷教授及宁夏大学/上海交大刘源教授等参与了AAT功能筛选和催化动力学机制解析研究；中国科学院大连化学物理研究所周雍进研究员和新加坡理工学院周康副教授参与了单萜烯醇及共培养生物合成途径构建研究。本研究得到国家自然科学基金、重点研发项目、卫健康委食品安全风险评估与标准制定实验室专项、上海市科技创新合成生物学专项及自然科学基金等资助。感谢中国科学院过程工程研究所李庭刚研究员提供丁酰辅酶A生物合成基因；感谢麻省理工学院Gregory Stephanopoulos教授对论文撰写提出的宝贵建议。