CRISPR/Cas9为遗传病治疗带来革命性突破，当前其安全性研究多聚焦脱靶引发的序列改变，往往忽视了对细胞表观基因组及功能的影响。近日，清华大学药学院李寅青副教授、自动化系张学工教授团队发文系统性揭示了CRISPR/Cas9基因编辑的潜在表观遗传风险：即便是在远离基因调控元件的非编码区进行编辑，也会引发大范围的染色质扰动，尤其可能导致成体干细胞、神经干细胞等干性细胞丢失自身干性特性，发生提前分化。团队还针对性提出了安全优化策略，为基因编辑技术的安全应用提供参考。

人类基因组中，编码蛋白质的区域仅占不到3%，剩下超97%的非编码区并非无用的DNA，而是分布着大量调控元件，它们通过复杂的染色质三维结构，调控基因表达，维持着细胞的独特身份——比如神经干细胞始终保持干性、持续分化产生神经细胞，就需要这些调控元件的稳定工作。

此前的基因编辑安全研究，大多聚焦在占基因组~3%的编码区的脱靶突变，对非编码区的编辑影响少于深入探索。而研究团队的研究发现，非编码区的基因编辑，即使切割位点远离调控元件，也可能引发连锁反应，这种影响还会因细胞类型不同产生巨大差异：在已分化的细胞中，编辑引发的染色质扰动范围较小，仅延伸几千碱基的距离；但在干性的细胞中，如小鼠胚胎干细胞等细胞中，扰动范围会放大数百倍，能延伸至几十万碱基的距离，在基因组里引起大范围的调控改变。

为了定量这种作用，研究团队构建了PSIchrom扰动跨度指数，能够根据细胞的基因表达谱，初步预测细胞对基因编辑扰动的敏感程度。PSIchrom指数在神经干细胞、成体干细胞中评分很高，也意味着它们是基因编辑中的敏感细胞，是值得重点关注的细胞群体。

引起研究团队特别关注的是，这种大范围的染色质扰动，对神经干细胞等干性细胞的影响尤为显著。实验中，研究人员在小鼠海马体的神经干细胞非编码区进行基因编辑，即便切割位点距离关键调控元件几万碱基的距离，仍观察到神经干细胞出现明显的提前分化，原本的干性细胞群体显著减少，分化出的神经母细胞数量显著上升。成体干细胞作为体内组织修复、再生的起始细胞，其干性的丢失，可能会直接影响组织的正常生理功能，这也意味着在基因编辑治疗中，干细胞的这类风险值得关注。

研究团队也解析了现象背后的生物学机制：干性细胞与分化细胞的DNA修复方式存在巨大差异。分化细胞主要通过快速的cNHEJ通路修复DNA断裂；但神经干细胞、成体干细胞等干性细胞，更倾向于非cNHEJ修复路径，可能引发大规模的DNA末端切除，形成延伸几十万碱基长度的单链DNA。这些单链DNA可能会破坏细胞的染色质三维结构：一方面让维持染色质架构的CTCF蛋白无法正常结合DNA，另一方面扰乱染色质凝聚体的远程调控作用，最终导致干细胞的关键干性基因表达失调，哪怕没有DNA序列的变化，比如大片段的DNA缺失等序列改变，干细胞也可能会丢了自己的干性特征，发生提前分化，失去原本的生理功能。

基因编辑扰动基因组并导致干细胞干性丢失

基于对风险机制的清晰解析，研究团队从编辑设计、药物干预、工具选择三个维度，提出了具有应用价值的优化策略，从源头减少染色质扰动，保护干细胞的特性：第一，距离感知型sgRNA设计：在设计sgRNA时，潜在脱靶位点应避开与关键调控元件（如超级增强子）在三维空间内邻近的位点；第二，小分子药物干预：使用抑制剂（如MRN抑制剂）适度抑制ssDNA切除过程，可在维持一定编辑效率的前提下，显著缩小染色质扰动范围，有效维持干细胞特性。第三，优化工具选择：相比于Cas9、Cas12a、引导编辑器，碱基编辑在相同位点基本不诱导染色质扰动，表现出更高的表观遗传安全性。

研究成果以“减少基因组编辑引发的远程染色质扰动有利于维持干细胞身份”（Minimizing far-extending chromatin perturbation in genome editing preserves stem cell identity）为题，于3月5日发表于《细胞·干细胞》（Cell Stem Cell）。

清华大学药学院副教授李寅青、自动化系教授张学工，已出站博士后朱明（现为华东师范大学研究员）为论文共同通讯作者；朱明，清华大学药学院袁俊松博士、孟秋辰博士，2021级博士生余嘉伟、徐晓庆为论文共同第一作者。

研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、北京市自然科学基金、清华-北大生命科学联合中心、北京生物结构中心、清华大学自主科研计划、高校青年教师科研创新能力支持项目的资助。