北京大学生命科学学院陆剑课题组、中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所谭文杰课题组和北京科兴中维生物技术有限公司合作在Genomics, Proteomics & Bioinformatics杂志在线发表了题为“Molecular evolution of protein ssequences and codon usage in monkeypox viruses”的论文。该研究揭示了在人群传播过程中，猴痘病毒（monkeypox virus, mpox virus, MPXV）蛋白质序列和密码子使用的分子演化规律。该研究发现MPXV演化过程中OPG027（VACV-Cop C7L，干扰素抑制基因）可能受到正选择。其次，该研究发现引起2022年猴痘疫情的MPXV变异株中不同基因的氨基酸变异可能具有上位效应（epistasis）。最后，该研究发现不同进化分支中MPXV变异株致死率的下降可能与密码子使用的去优化相关。

1958年，MPXV在丹麦的一个动物机构中被首次发现。1970年，MPXV在刚果民主共和国首次从人类病例中被分离出。在2022年之前，MPXV主要在中非和西非地区流行。2022年5月7日，英国报道发现猴痘病例。随后，世界各地陆续报道猴痘病例的出现。2022年7月23日，猴痘疫情被宣布为国际公共卫生紧急事件。据世界卫生组织报道，截至2023年9月11日，115个国家和地区发现了9万多猴痘确诊病例。猴痘疫情给全球人类健康造成了严重的威胁。2022年9月16日，我国重庆地区报告了大陆地区首例猴痘输入病例。截至2023年12月14日，我国大陆地区已累计报告猴痘病例1660例（数据来源：中国疾病预防控制中心）。MPXV主要分为两个进化枝:CladeI（曾被称为“中非分支”）和CladeII（曾被称为“西非分支”）。Clade II由IIa和IIb亚分支构成，IIb可进一步细分为谱系A和B（CladeIIb-AandIIb-B）,引起2022年猴痘疫情的MPXV变异株主要属于IIb-B（图1A）。

为了探究MPXV演化过程中的适应性演化，该研究对MPXV所有的基因在不同进化谱系间进行比较，发现CladeIMPXVOPG027（干扰素抑制基因）可能受到正选择。通过分析1952条MPXV基因组序列发现，CladeIMPXV祖先序列的OPG027发生了3个氨基酸变异（I47V，F79L和V126I）和1个同义突变（C276T），其中F79L变异位于OPG027的关键疏水位点，I47V和V126I分别位于OPG027的2个β-sheet。而CladeIIa、IIb-A和IIb-BMPXV祖先序列的OPG027均没有发生变异（图1A）。有研究报道，痘苗病毒C7L（C7L是OPG027的直系同源基因）的79位点可能直接影响C7L和人类抗病毒蛋白SAMD9的结合，对病毒在人细胞中的生长至关重要。因此，F79L（可能与I47V和V126I一起）可能影响MPXV的传播、致病性或免疫逃避能力。未来有必要对其功能方面进行进一步地研究，以确认这些突变的生物学意义。

SARS-CoV-2基因组内的许多突变之间存在强连锁。为了探究这种模式是否也存在于引起2022年猴痘疫情的MPXV变异株（CladeIIb-B），该研究鉴定出了15个突变连锁群，其中13个连锁群包含至少1个非同义突变，6个连锁群包含2个及以上非同义突变（图1B）。这些连锁突变分布在多个涉及病毒感染或抗宿主免疫基因中，可能会影响MPXV的适应性。因此，需要进一步的研究来阐明这些连锁突变的生物学意义和它们的上位效应。

生物体内的蛋白质主要由61个密码子编码的20种常见氨基酸组成。除蛋氨酸和色氨酸外，剩下的18种氨基酸由至少2种密码子编码，这种现象称为遗传的简并性。编码同一种氨基酸的密码子互称为同义密码子。尽管同义密码子编码相同的氨基酸，但是在基因组中的使用频率并不一致，因此产生了密码子使用偏好性。由于同义突变不改变氨基酸，通常被认为不会对细胞功能及生物体的适应性产生影响。然而，近年来陆续有研究指出，同义突变可能会影响mRNA的翻译效率、稳定性及蛋白质的折叠等过程，进而影响生物体的适应性。病毒的生命活动完全依赖于宿主细胞内的资源（例如：核糖体和tRNA等翻译机器），因此病毒密码子使用可能会影响病毒蛋白质的表达，进而影响病毒的复制、传播和致病性等。密码子适应指数（Codon Adaptation Index, CAI）能够反映病毒和宿主间密码子使用偏好的差异，CAI越接近1暗示病毒越倾向于使用宿主偏好的密码子。该研究通过计算1952条MPXV基因组序列的CAI发现，MPXV倾向使用人类基因组中非偏好性的密码子。而且MPXV的CAI随着时间的推移而下降，并在不同的分支之间存在差异，其中Clade I>IIa和IIb-A > IIb-B（图1C）。密码子的持续去优化可能是由APOBEC3介导的C>T或G>A突变驱动的。值得注意的是，MPXV各分支之间的致死率也存在显著差异，Clade I>IIa和IIb-A > IIb-B（图1D）。由于具有显著翻译活性的病毒可能会给宿主带来翻译负担并引起严重的临床症状，MPXV密码子使用的去优化可能导致病毒在进化过程中复制减缓，从而降低致死率。不过，目前尚不清楚这种相关性是巧合还是存在因果关系，需要进一步的研究验证。此外，通过大规模密码子去优化以降低蛋白质合成速率来降低病毒毒力的方法已成为制备减毒疫苗的一种有前景的方法，并已经在脊髓灰质炎病毒和甲型流感病毒等进行了大规模探索。鉴于目前对MPXV疫苗的迫切需求，同样的策略有可能被用于开发基于MPXV的减毒病毒疫苗。

图1. 猴痘病毒OPG027在不同分支的演化、连锁的氨基酸变异以及密码子使用和致死率的变化趋势（Shanet al., 2023, Genomics Proteomics Bioinformatics）

获得高翻译效率的序列是mRNA疫苗设计过程中的关键步骤之一。鉴于密码子使用在蛋白质表达中的重要性，陆剑团队先前（2023年6月2号）与钱朝晖团队在Advanced Science发表的文章“Optimization and deoptimization of codons in SARS-CoV-2 and related implications for vaccine development”中发现新冠病毒也倾向使用人类基因组中非偏好性的密码子（图2A），而且单个同义密码子的改变能够影响蛋白质的表达量（图2B）。基于人类密码子使用情况对SARS-CoV-2刺突蛋白基因进行序列优化，能够获得高蛋白表达量的新冠病毒mRNA疫苗序列（图2C）。相同的方法未来也可以用于猴痘病毒mRNA疫苗的序列设计。

图2. 新冠病毒密码子使用对蛋白表达的潜在影响（Wuet al., 2023, Adv. Sci.）

总的来说，该研究揭示了在人群传播过程中MPXV蛋白质序列和密码子使用的分子进化规律，并提示人们注意MPXV密码子使用和致死率之间的潜在关系，为深入理解病毒与宿主细胞的相互作用机制提供了新的视角。

陆剑、谭文杰和北京科兴中维生物技术有限公司胡雅灵博士为该研究的通讯作者，科兴中维-北京大学联合培养博士后单科家和中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所吴长城助理研究员为本文的共同第一作者，生科院博士后唐小鹿和中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所主任技师陆柔剑也为该工作作出了重要贡献。该工作得到了国家科技部、国家自然科学基金委、北京市自然科学基金委、北京大学生命科学学院启东产业创新基金和北京市博士后工作经费资助项目等的支持。