在冷冻电镜样品制备过程中，生物大分子需包埋于玻璃态薄冰层中。样品的冰层厚度直接决定了背景噪音与生物大分子颗粒的空间分布，最终影响可达到的结构解析分辨率。尽管经过数十年的努力，冷冻电镜样品制备的冰层厚度控制始终难以实现；现有技术所制备的样品重复性差、冰层厚度不均，厚度控制仍然主要依赖试错。

9月25日，清华大学生命科学学院王宏伟教授团队、北京大学化学与分子工程学院彭海琳教授团队、香港大学生物科学学院刘楠助理教授团队等合作在《自然·方法学》（Nature Methods）在线发表题为“基于限域结构实现冷冻电镜样品制备的冰层控制”（Control of ice thickness in cryo-EM via confinement”的研究论文。该工作揭示，亚100纳米薄液膜的不稳定性是实现冷冻样品冰层精准控制的核心瓶颈，并设计实现“石墨烯储液池”（graphene reservoir）的限域结构来进行冰层厚度的精确控制。该工作基于光刻技术构造多孔碳膜阵列，并利用石墨烯的自发贴壁效应下凹形成“石墨烯储液池”；随后将这一设计用于冷冻电镜样品制备，可精确控制样品的冰层厚度，所得冰层厚度具有大面积均匀性好、重复性高的优势，为高分辨率冷冻电镜结构解析提供了一种新的制样策略。

图1. 限域结构解决冷冻电镜冰层控制难题

冷冻电镜样品制备过程中的玻璃态冰层由薄液膜快速冷却形成，因此冰层厚度精确控制的瓶颈在于液膜本身的稳定性。理论计算表明，当液膜厚度低于约100纳米这一冷冻电镜成像所需的厚度范围时，液膜变得不稳定并发生自发减薄，驱动着液体从较薄区域向邻近较厚区域迁移——在较厚区域，范德华相互作用在能量上更为有利。这种能量驱动的液体迁移使得薄液膜易于破裂甚至形成微观液滴，这一过程难以预测和控制。薄液膜这种不稳定性从根本上制约了冷冻样品冰层制备的均匀性和重复性，是此前常常被忽视的冰层厚度控制的关键因素。

为克服上述问题，研究团队提出了一种限域结构设计：当把石墨烯转移到均匀的中空孔阵列上后，在范德华力的作用下，石墨烯会出现自发的贴附孔壁现象，并向下凹陷形成“石墨烯储液池”； 通过调控“储液池”凹陷深度，定义最终的冷冻样品冰层厚度。但这一设计的实现并不容易，团队发现常用的多孔碳膜电镜载网孔边缘尖锐突出，且异质性较强，导致石墨烯转移后向外凸起，难以得到稳定可控的下凹深度，不利于冰层厚度控制。因此他们引入了半导体领域常用的深紫外光刻技术（DUV），从头制备了孔边缘光滑的均匀多孔碳膜阵列，并将石墨烯转移至多孔碳膜阵列上，最终得到了均匀下凹的“石墨烯储液池”。随后，研究团队发现通过调节孔直径、孔边缘曲率和石墨烯层数等参数，可精确调控石墨烯储液池的深度：当孔直径为600~2000纳米时，石墨烯储液池深度可在10~40纳米之间调节。此外，该设计在多种商用载网上也均得到验证：例如，将石墨烯转移到孔边缘无明显凸起的商用载网如ANTCryo、C-flat、Quantifoil背面和UltrAufoil背面，石墨烯均存在一定程度的凹陷深度，这进一步证明了该设计的普适性。

得益于上述限域结构，在使用常规制样方法吸去载网上的绝大部分液体之后，液体能够自发地从较薄的外围区域向较厚的石墨烯储液池内进行迁移，使体系表现出优异的储液能力。在实践中，即便将滤纸夹吸载网的时间延长至10秒甚至20秒（约为常规石墨烯载网操作时长的5至10倍），液膜仍能保持稳定在约30纳米厚度。这一厚度的冰层适合大部分生物大分子的高分辨率冷冻电镜成像：既能有效封装生物大分子，同时也不会引入额外的背景噪音。更重要的是，冰层厚度与储液池深度高度吻合：通过调节储液池深度，可实现15 nm、20 nm、30 nm和40 nm的冰层厚度可控制备，并在载网尺度表现出稳定的大面积均匀性。这表明，这种限域设计不仅能有效抑制薄液膜失稳，也为冰层厚度的精确调控提供了可靠途径。

图2.“石墨烯储液池”能够精准调控冰层厚度，并实现冰层厚度的大面积均一性与可重复性

研究团队进一步将该设计拓展至更具挑战性的“石墨烯三明治”体系。团队此前开发的“石墨烯三明治”技术（PNAS，2024）虽可有效避免气液界面等问题，并在生物学、材料科学、化学等领域备受关注，但其广泛应用长期受限于厚度难以控制的问题。实验结果显示，基于石墨烯储液池的“石墨烯三明治”结构可形成厚度约30纳米的均匀冰层，与储液池的下垂深度高度匹配；相比之下，传统石墨烯三明治的冰厚约为52±18纳米，且不同区域差异较大。并且，基于该结构的“石墨烯三明治”封装成功率超过90%，显著高于基于传统载网制备的“石墨烯三明治”结构（约67%）。与此同时，在石墨烯储液池所制备的“石墨烯三明治”结构中，电子束辐照下样品位移明显降低且差异较小，图像质量也随之提升。此外，当石墨烯层数从单层增至三层时，随着石墨烯的二维杨氏模量提高，石墨烯下凹深度减小，冰层厚度因此可从约30纳米进一步调节至约19纳米，这一结果与理论模型预测相符。上述结果表明，该限域设计不仅在传统多孔阵列载网上有效，在“石墨烯三明治”制样构型中同样具有良好的适用性、稳定性和可调控性。

图3. 石墨烯三明治结构中的冰层厚度控制

在冷冻电镜成像中，厚度可控且均匀的冰层为生物大分子提供了良好的衬度和信噪比，使该设计成功应用于多种生物大分子的高分辨率三维重建。其中，LL.LtrB group II intron RNA、SARS-CoV-2 spike蛋白和小蛋白streptavidin的三维重建分辨率分别达到2.7 ?、2.9 ?和2.5 ?。这些生物大分子颗粒主要吸附在石墨烯-水界面，远离气液界面，从而缓解了颗粒变性、聚集和优势取向等问题。此外，“石墨烯储液池”载网还可适用于近年来新兴的喷雾制样技术（spray methods），在没有滤纸夹吸等外界扰动的情况下，有效促进微量液滴在载网上快速自发铺展，为时间分辨冷冻电镜和原位液相电镜等新兴技术提供了新思路。

该研究聚焦冷冻电镜样品制备过程中薄液膜不稳定的热力学限制，将长期依赖经验的冰层厚度控制转变为可设计、可制造的限域结构工程。这一设计从一个简单的载网拓扑结构出发，不仅解决了冷冻电镜制样中的关键瓶颈问题，也为研究限域液体中的物理、化学和生物过程提供了有力工具。

王宏伟教授、彭海琳教授、刘楠助理教授为论文共同通讯作者；北京大学化学与分子工程学院博士后郑黎明、清华大学生命科学学院2021级博士生宋佶岭、北京大学化学与分子工程学院2026届博士毕业生赵效乐为论文共同第一作者。

研究工作得到科技部重点研发计划、国家自然科学基金、北京分子科学国家研究中心、北京生物结构前沿研究中心、清华-北大生命科学联合中心、腾讯新基石科学基金会、深圳市医学研究专项资金等资助，并得到清华大学冷冻电镜中心和计算中心的技术支持。