在哺乳动物细胞中，DNA甲基化修饰参与调控基因组印记、X染色体失活、转座子沉默以及衰老和肿瘤发生等重要生物学过程。DNA甲基化模式的维持，依赖于UHRF1介导的泛素化信号轴。UHRF1作为连接DNA甲基化与组蛋白修饰的关键因子，能够识别半甲基化DNA，并结合组蛋白H3第9位赖氨酸三甲基化（H3K9me3）这一异染色质标记，进而催化组蛋白H3 N端第14、18、23位赖氨酸（H3K14/18/23）的单泛素化，为后续招募甲基转移酶DNMT1提供信号基础。由于天然核小体含有双拷贝的四种核心组蛋白，UHRF1识别H3K9me3后，其催化的泛素化是发生在同一条H3尾部（即顺式，in cis），还是作用于另一条H3尾部（即反式，in trans）？这一问题的回答，直接关系到我们对UHRF1催化调控基本逻辑的理解——不同激活模式意味着UHRF1在染色质上的作用半径和信号输出方式存在本质差异，进而可能影响下游DNMT1的招募效率与DNA甲基化维持的保真度。

然而，此前研究主要基于组蛋白多肽开展，而常规核小体组装方法难以精确区分两条H3的修饰状态，成为解析这一机制的主要技术瓶颈。近日，上海交通大学药学院艾华松课题组通过化学生物学方法精准构建的不对称核小体揭示了核小体上甲基化与泛素化顺式激活的调控模式，相关成果以“Chemical Synthesis of Asymmetric Nucleosomes Reveals Intramolecular Activation of UHRF1 E3 Ligase by H3K9me3”为题发表于《Journal of the American Chemical Society》。

为破解天然核小体对称性带来的研究困境，课题组利用SpyTag/SpyCatcher生物正交共价偶联体系，成功构建了三类化学组成精准的不对称核小体，实现了 H3K9me3修饰与泛素化位点空间排布的定向操控。研究首先通过半胱氨酸烷基化化学在H3第9位定点引入三甲基赖氨酸，并在H3 N端融合携带TEV蛋白酶切位点的SpyTag或SpyCatcher标签；利用两者自发形成不可逆异肽键的特性，将修饰状态不同的两条H3定向交联为异二聚体，再与H2A、H2B、H4组装为不对称八聚体，并包裹含侧翼半甲基化CpG位点的187 bp DNA，最终经TEV酶切获得无痕的不对称核小体。三类核小体分别设计为：仅允许顺式激活的顺式核小体（H3K9me3与泛素化位点位于同一条H3）、仅允许反式激活的反式核小体（H3K9me3位于不可泛素化的H3，泛素化位点位于另一条H3），以及不含H3K9me3修饰的失活对照核小体。所有产物均经ESI-MS、SDS-PAGE、Native-PAGE及免疫印迹等多方法验证（图2）。

基于三类不对称核小体底物，课题组开展了UHRF1体外泛素酶活定量分析。结果表明，顺式核小体的H3泛素化转化率达到26.8%，显著高于反式核小体（14.9%）和失活对照（13.6%）；反式核小体与对照之间无统计学显著差异，提示H3K9me3在反式构型下几乎不能有效激活UHRF1。在UbcH5b浓度梯度（0.1～12.8 μM）实验中，顺式底物的催化速率在全浓度区间均高于反式底物，进一步支持该偏好性的稳健性。电泳迁移率变动分析（EMSA）显示，UHRF1对顺式与反式核小体的结合亲和力相近，表明催化效率差异并非源于结合强弱，而可能反映不同空间排布下构象识别方式的差异。抗H3K9me3免疫印迹进一步证实，泛素化主要发生在携带H3K9me3修饰的同一条H3尾部，而在反式体系中，带甲基化修饰的H3几乎不产生泛素化信号（图3）。以上结果首次在核小体层面提供了H3K9me3以顺式模式激活UHRF1的直接证据。

为探究顺式激活的分子空间基础，研究团队进一步采用CAET（2-((2-氯乙基)氨基)乙硫醇）介导的共价偶联化学与gp41-1分裂内含肽剪接技术，合成了稳定的UHRF1/UbcH5b–Ub/H3K9me3核小体三元复合物模拟物，以捕获瞬时的催化中间体。选择体内主要的泛素化位点H3K23为锚点，通过CAET化学将IntC–UbcH5b–Ub模块定点连接至H3K9me3修饰的H3上，构建顺式探针；同时将gp41-1内含肽N端片段（IntN）融合于UHRF1 C端，通过自发剪接实现UHRF1与UbcH5b的共价连接，从而固定催化模块与底物尾部的相对位置（图4）。

随后，研究利用BS3交联剂对该复合物进行交联质谱（XL-MS）分析，共鉴定到101组独特的赖氨酸–赖氨酸交联肽段，涵盖UHRF1结构域内部、组蛋白内部、UHRF1–组蛋白以及UbcH5b/泛素相关交联信号。基于交联距离约束（Cα–Cα < 30 ?）并整合已有结构信息进行约束性对接，获得顺式复合物的空间参考模型。该模型显示：TTD–PHD模块邻近H3K9me3修饰的H3尾部；SRA结构域呈结合半甲基化DNA的经典构象；UBL结构域与UbcH5b、RING结构域与H3泛素化赖氨酸（K23）均存在近距离交联，支持催化模块与同一H3尾部的空间匹配；同时检测到UHRF1与核小体酸性补丁区域的接触，提示多点锚定可能有助于稳定催化构象（图5）。

该研究揭示的顺式激活机制，为理解 DNA 甲基化维持通路的空间调控逻辑提供了新的实验依据。顺式构型使 H3K9me3 与 H3K18/23Ub 修饰共存于同一条 H3 尾部，形成连续的多价识别表面，与已报道的 DNMT1 RFTS 结构域结合偏好相契合，推测该排布有助于提升 DNMT1 的招募与激活效率；反式模式下两种修饰分属不同 H3 尾部，或在一定程度上削弱多价协同效应。同时，UHRF1 催化模块限定于同一 H3 尾部附近，利于连续催化生成 H3 双泛素化信号，配合去泛素酶 USP7 的活性调节，可实现对 DNMT1 功能的精细调控。该工作整合化学蛋白质合成、不对称核小体构建、催化中间体捕获与交联质谱解析等多学科技术手段，在核小体层面明确了 H3K9me3 对 UHRF1 的顺式激活模式，为 DNA 甲基化维持通路的空间调控提供了机制层面的参考，也彰显了化学生物学方法在解析染色质复杂调控机制中的独特价值。