叠层成像（Ptychography）是一种基于衍射数据和相位恢复算法的计算成像技术，具有突破传统电子显微成像分辨率限制的潜力。近年来，将叠层计算成像引入冷冻电镜领域，可能是解决当前冷冻电镜技术面临的诸多瓶颈问题的极具潜力的解决方案。然而，受生物样品低剂量、大视野成像条件的限制，目前基于叠层成像的单颗粒三维重构分辨率仍停留在亚纳米水平，其分辨率制约因素尚不清楚。在生物样品叠层成像实验中，通常需要在微米级视野内以纳米级步长进行阵列扫描，电子束扫描步长是连接实验数据采集与计算重构的重要参数。由于在冷冻电镜工作条件下经常难以找到合适的标定样品，校准的扫描步长可能存在较大误差，这可能对叠层成像中的信息传递造成干扰，并进一步影响后续的结构分析。

清华大学生命科学学院李雪明教授课题组和清华大学电子工程系沈渊教授课题组联合以“基于叠层成像的单颗粒分析中的采样失配问题与校正方法”(Sampling Mismatch and Correction for Ptychographic Single-Particle Analysis)为题，于9月11日在《超显微术》（Ultramicroscopy）杂志在线发表研究论文，报道了生物样品叠层成像采样失配（Sampling Mismatch）的机理及矫正方法。

论文首先将生物样品叠层计算成像中难以精确标定的实空间扫描步长和可精确标定的傅里叶空间探测器像素大小联合分析，揭示了二者的校准误差（通常是扫描步长不准确）会导致计算系统参数的错配问题，称为采样失配。采样失配会对叠层成像重构的二维照片及单颗粒三维重构造成结果（图1），体现为照片像素大小的改变（显式影响），以及在照片的频域空间中出现具有相位振荡反转特性的调制现象（隐式影响），这些最终会制基于约叠层成像的单颗粒分析的最终三维重构分辨率。研究团队建模了采样失配与各种观测现象间的定量关系，将叠层成像的计算过程具象化为一种虚拟的光学系统，提出了“采样失配诱导的信息调制函数”这一概念，并据此预测了采样失配程度对单颗粒三维重构分辨率的定量限制关系。以这些理论分析为基础，研究团队通过比较蛋白质三维重构与实际蛋白质结构的缩放关系，提出了扫描步长的精确标定方法，从而有效避免了采样失配造成的各种问题。

图1.采样失配问题及其影响

通过分析多种来源的数据集，研究团队发现在不耐辐照的冷冻生物样品应用中，普遍存在扫描步长偏差较大的问题，使得采样失配成为潜藏的制约基于叠层成像的单颗粒分析分辨率的重要因素之一。测试表明，论文所提的扫描步长校正方法可有效消除单颗粒三维重构中傅里叶壳层相关（Fourier Shell Correlation，FSC）曲线中的异常振荡（图2a），提升结构解析分辨率（图2b）。目前，该方法和相关理论已在更多的工作中得到了进一步的验证。

图2.采样失配问题矫正前后结果对比

李雪明教授和沈渊教授为本文的共同通讯作者；清华大学生命科学学院联合培养的电子工程系2022级博士生李天元为该论文的第一作者。清华大学生命科学学院博士后李首卿（已出站）、膜生物学全国重点实验室2024级博士生闫昭屹为数据采集与分析做出了重要工作。

本研究工作获得了科技部、国家自然科学基金委、生命科学联合中心、北京生物结构前沿研究中心、深圳医学科学院等的资金支持，并得到了国家蛋白质科学研究（北京）设施清华基地的技术和设备支持。