细胞膜电位的动态变化是神经元编码信息和相互通信的“语言”。相比传统基于电极记录的膜片钳技术，利用荧光成像方法记录细胞膜电位具有非侵入式检测、高测量通量等优势，逐渐在检测可兴奋细胞电信号的时空动态变化方面崭露头角。其中，基于电压敏感蛋白质的遗传编码膜电位探针能够实现细胞特异性电活动检测，已在脑成像方面得到广泛应用。然而目前灵敏度较高的几类膜电位探针主要发射绿色荧光，而在红色荧光发射波段的探针灵敏度普遍较低。

2023年11月22日，北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命科学联合中心、IDG麦戈文脑科学研究所、合成与功能生物分子中心邹鹏研究员课题组，在Science Advances发表题为“Bright and sensitive red voltage indicators for imaging action potentials in brain slices and pancreatic islets”的论文。他们基于电致变色能量共振转移（electrochromic Fluorescence Resonance Energy Transfer, eFRET）机制，进行了遗传编码膜电位探针的理性设计，对微生物视紫红质及红色荧光蛋白的融合蛋白进行了工程改造，开发了具备高信噪比的红色荧光遗传编码膜电位探针：Cepheid1b和Cepheid1s。具有红移光谱的Cepheid1b和Cepheid1s能够在多通道成像中搭配蓝光激活的光遗传学或荧光工具，对兴奋性细胞的生理活动进行多维监测。在小鼠大脑切片和胰岛组织中，Cepheid1b的膜电位检测能力得到了充分验证。

基于eFRET机制的膜电位探针由产生信号的荧光蛋白以及包含生色团且对膜电位敏感的视紫红质蛋白组成，两者构成荧光共振能量转移（FRET）供体-受体对。提高FRET效率对改进膜电位探针表现至关重要，而前者由等供受体距离、光谱重合度、荧光团分子朝向等多方面因素决定。此前的相关尝试集中在缩短供体-受体距离方面，即减少连接二者的氨基酸残基数目。邹鹏课题组依照此前工作积累的经验，并通过AlphaFold2模型的结构预测发现，将荧光蛋白嵌入视紫红质的胞外环区不仅可以进一步缩短供受体距离，还显著改善了FRET供体和受体分子间的相对朝向。根据计算预测结果构建的若干探针在HEK293T细胞及小鼠原代神经元中得到了测试。最终，以Acetabularia Rhodopsin II为FRET受体骨架、以储军课题组开发的mScarlet-I1.4和mRuby4为FRET供体的融合蛋白展现出了最高的膜电位响应灵敏度。依据其分别更高的荧光强度和光稳定性，两探针被命名为Cepheid1b及Cepheid1s。

图1. Cepheid1b/s探针的设计结构，其膜电位响应能力超过了以往的红色探针

Cepheid1b/s凭借其红移光谱的特性，能够与蓝色光谱激活的光遗传学工具联合使用，由此实现了全光学的电生理刺激与检测（图2）。多色成像也扩展了膜电位探针的应用范围，在Cepheid1b和GCaMP6s共表达的离体神经元内，Cepheid1s清晰指示了细胞内钙离子信号升高过程中的电生理特征，该种多色成像也在离体胰岛细胞内得到了验证。除了钙信号伴随的膜电位成像，Cepheid1b也能够与谷氨酸探针共成像，指示谷氨酸神经递质调控过程中的电生理变化（图2）。

图2. Cepheid1b/s与蓝光激活的光遗传学工具，绿色光谱钙探针、递质探针多色成像

除了细胞水平的表征和应用，Cepheid1b也在急性鼠脑切片、离体胰岛组织内进行了成像。对鼠脑急性脑切片进行大视野成像的实验中，Cepheid1b在能够捕捉到丘脑内超过20个单个神经元的自发动作电位发放（图3）。对于胰岛这一调节血糖的关键组织，Cepheid1b搭配钙成像，从电生理层面揭示了外液葡萄糖浓度切换状态下，胰岛的兴奋性变化呈现出细胞个体的异质性（图3）。

图3. Cepheid1b在鼠脑急性脑切片和胰岛组织内的应用

综上，邹鹏课题组基于电致变色能量共振转移原理和AlphaFold2模型的预测，理性设计出了灵敏度与信噪比提升的红色荧光遗传编码膜电位探针Cepheid1b和Cepheid1s。Cepheid1b/s不仅能够支持多色成像，也在急性脑切片、胰岛组织内表现出了出色的膜电位指示能力。该工作不仅迭代出了更高灵敏度的探针，也扩展了探针的开发思路。近年来，功能性膜电位成像应用深度和广度不断拓展，朝着更多样的研究体系、更深层的在体观测区域、更长的记录时长迈进。预计Cepheid1b/s探针将帮助研究者更有效地解析动物行为学背后的神经调控功能，更加准确地评估胰岛响应环境的电生理性质。

北京大学化学与分子工程学院本科生韩易、北京大学生命科学学院PTN项目博士生杨钧淇、北京脑科学与类脑研究所博士后李源、北大-清华生命科学联合中心博士生陈煜为该论文的共同第一作者。杨钧淇与邹鹏为该论文的共同通讯作者。该工作得到了国家自然科学基金委、科技部、北大-清华生命科学联合中心、北京分子科学国家研究中心、生物有机与分子工程教育部重点实验室的资助。