轴手性（Atropisomerism）是一类因单键旋转受限而形成的稳定立体异构体，其构型稳定性主要取决于旋转势垒及空间位阻效应。这类化合物广泛存在于天然产物、药物分子以及手性配体和有机小分子催化剂中。如何高效且选择性地构建轴手性化合物，一直是合成化学和生物催化领域的研究热点。

轴手性化合物的对映选择性合成主要有两种策略：一种是基于已有的（潜）手性轴，通过天然酶催化的不对称转化（如动力学拆分）来实现手性轴的选择性构建；第二种方法则是直接构建新的手性轴。尽管相关研究已取得重要进展，但总体而言，生物催化在轴手性骨架的构建方面仍局限于少数的逆合成策略和反应类型，与化学合成方法相比仍存在较大差距。

9月10日，清华大学生物医学交叉研究院刘臻实验室与黄牛团队合作，在《自然·合成》（Nature Synthesis）杂志发表了题为“分子动力学模拟引导下黄酮类酶的定向进化”（Molecular-dynamics-simulation-guided directed evolution of flavoenzymes for atroposelective desaturation）的研究论文。该研究报道了一种基于定向进化策略开发的创新性生物催化方法，研究团队利用来源于Parageobacillus thermantarcticus的黄素酶PtOYE，通过工程化改造获得了具有对映选择性去饱和活性的变体，从而实现了轴手性联芳基化合物的高效合成。值得一提的是，分子动力学模拟（MD simulation）在定向进化进程中发挥了关键作用，该技术揭示了催化反应过程中酶的潜在构象变化，并在此基础上识别出此前在PtOYE及其同类酶中未被发现的重要残基。以此为指导获得的工程化酶ADes-5相较于初始变体（PtOYE-Y28F），其催化效率（kcat/KM）提升了70倍以上。

此外，研究团队通过X射线晶体学手段解析了ADes-5的结构（PDB：9IUV），确定了其活性中心和整体的结构特征。该工程化酶能够将多种1-芳基-2-四氢萘酮底物以很高的收率和良好的对映选择性转化为相应的联芳基产物，进一步的衍生反应展示了合成产物在多官能团轴手性分子构建中的广泛应用潜力。

图1.轴手性化合物的生物催化策略

为提高筛选效率，研究团队采用了MD模拟指导的蛋白质工程策略。研究团队首先基于AlphaFold2预测的ADes-1结构以及PtOYE的催化机制，将底物1a的两种对映体分别对接至酶的活性口袋中。其中R构型由于在对接过程中与活性位点存在严重空间位阻而被排除；而（S）-1a存在两种可能的结合模式，这两种结合模式的主要差异存在于萘环取向：在Conf-I模式中，底物甲氧基朝向活性位点外侧；Conf-II模式中，底物甲氧基朝向活性位点内侧并与S249和R215形成相互作用（图2b）。

研究团队在此基础上对两种结合模式的复合物结构分别进行了MD模拟，模拟结果显示在Conf-II模式中，随着底物分子的结合，PtOYE蛋白发生了显著的构象变化：Loop I和Loop II之间的“锁扣”结构打开，同时Loop I向内关闭稳定了底物结合（图2d）；而在Conf-I模式的MD结果中，未观察到类似的构象变化，同时底物分子结合不稳定（图2c）。MD模拟说明了Conf-II模式的合理性以及构象变化在稳定底物结合过程中的重要性，揭示了PtOYE催化底物反应的潜在结构动态机制。

对模拟结果中的结构进一步可视化分析表明：第一，在初始构象中，Loop II上的F124与LoopI上的P255和A252通过疏水相互作用形成“锁扣”结构，限制了Loop I的闭合；第二，在最终的Loop I“闭合”构象中，疏水残基V254靠近底物并形成新的相互作用（图2d）。基于这些结构与动态信息，研究团队对F124、V254和P255三个位点进行了位点饱和突变筛选，旨在打破“锁扣”构象并稳定“闭合”构象，从而促进底物的结合和催化。筛选得到的F124Q与V254F变体分别对反应收率提升了3.8倍和3.4倍，二者组合后得到的双突变体ADes-4，使产率提升至50%，对映选择性达到88% e.e.。进一步在A252位点进行突变和筛选，获得了催化性能最优的ADes-5，其产率高达98%，对映选择性为89% e.e.，和初始变体ADes-1相比，产率提升了45倍。

图2.分子动力学模拟指导的定向进化

为深入理解蛋白质工程对于轴手性脱氢酶性能的影响，研究团队测定了进化谱系中四个ADes变体的动力学参数。实验结果表明，F124Q和V254F两个突变显著提高了酶的催化活性，使ADes-4的催化速率（kcat）和ADes-1相比提高了26倍，同时表现出更低的KM值，表明底物亲和力增强。最终获得的ADes-5变体展现出最优的催化性能，其催化效率kcat/KM较初始变体提升了70倍。这些观察结果与研究团队基于MD模拟所建立的机制模型相一致。

图3.ADes变体动力学参数的测定

在确定最优变体ADes-5后，研究团队评估了其在多种1-芳基-2-四氢萘酮衍生物上的适用性。结果表明该酶对芳环的各种取代基都表现出显著的耐受性，无论是卤素、杂环还是氧化敏感的底物，均可被高效转化为目标联芳基产物，且具有良好的产率与对映选择性。

图4.酶催化反应底物的拓展

图5.制备级规模的放大和产物的衍生化

综上所述，这项工作证明了黄素依赖的脱氢酶可以用于轴手性分子的合成，扩大了这类酶的已知用途。同时，MD模拟有效预测了催化反应过程中酶的构象变化，并识别出以前在PtOYE和相关酶中未识别的重要残基，表明通过调控柔性loop的构象动力学可有效调节酶的催化活性，这一策略也为其他与生物催化转化相关的蛋白质体系的设计和优化提供了重要参考。

刘臻实验室2022级博士生尹红宁和黄牛实验室博士后陈钊为论文共同第一作者；刘臻研究员和黄牛研究员为论文通讯作者。研究得到科技部、清华大学生物医学交叉研究院以及北京生命科学研究所的资助。