冷冻电子断层成像（cryo-electron tomography, cryoET）技术可以观察细胞中生物大分子的原位结构，近年来受到了广泛关注。生物样品在冷冻电镜成像的过程中受到衬度传递函数（contrast transfer function,CTF）的影响，无法直接反映原始的结构信息。在实现高分辨率的蛋白质结构解析和电镜图像质量评估的过程中，依托CTF准确估计离焦量参数，对后续消除CTF的影响十分重要。

目前常用的离焦量估计方法通常依托图像功率谱中的CTF衍射环（Thon ring）进行估计。冷冻电子断层成像倾转系列图像信噪比非常低，且由于样品倾转引起照片中的离焦量随样品高度连续变化。这些因素导致高倾转角度下拍摄的电镜照片功率谱中没有清晰的CTF衍射环，导致难以精确估计样品的成像离焦量。此外，通过冷冻聚焦离子束（cryo-focused ion beam, cryoFIB）减薄方法制备的薄片样品与样品台之间常常存在一个十几度的夹角，称为绝对倾角偏移。该偏移会影响照片局域离焦量的估计，进而影响整体离焦量估计结果的准确性。

5月31日，清华大学生命科学学院李雪明副教授课题组和电子工程系沈渊教授课题组联合在《结构》（Structure）杂志在线发表研究论文，题目为“基于冷冻电子断层成像倾转系列照片的离焦量联合估计方法”（Tilt-series-based joint CTF estimation for cryo-electron tomography）。该论文报道了一种基于全部倾转系列照片的联合估计方法（图1）。该方法首先利用整套倾转系列数据来生成并估计整套数据的平均离焦量。其中通过引入一种尺度变换（Thonring rescaling）的方法，将不同离焦条件下的功率谱进行缩放，使其中的CTF衍射环能够被对齐并平均，从而获得高信噪比的平均功率谱。接下来，该方法依托平均离焦量作为初始值，对倾转系列中每张照片的离焦量进行局部估计优化，以提升单张照片的离焦量估计精度。在上述估计的过程中，该方法还包括了基于图像灰度均值的绝对倾角偏移估计方法，以及通过将离焦量与绝对倾角偏移和面外倾角（x-tilt）进行联合建模，在改善离焦量估计准确性的同时，实现对样品三维倾角的精确测量。

图1.CTFMeasure算法流程图

研究团队基于上述联合估计方法，开发了名为CTFMeasure的新软件。测试表明，相对于已有方法，CTFMeasure可以在功率谱中展现出更加清晰的CTF衍射环花样（图2）；并以此为依托，在实现准确离焦量估计的同时，为用户基于CTF衍射环的数据质量评估提供数据支持。实验表明，使用CTFMeasure估计的离焦量可以为子断层平均（subtomogram averaging）提供更加精确的初始离焦量估计，为获得高分辨率的蛋白质结构三维重构提供有力支持。更好的离焦量初始值也有助于减少三维结构解析计算的迭代轮数，提高计算效率（图3）。

图2.绝对倾角偏移估计与经历尺度变换后的CTF衍射环（Thon ring）对比

图3.子断层平均结果对比

李雪明和沈渊为论文共同通讯作者，清华大学电子工程系2020级博士生张冉颢为论文第一作者。研究得到国家自然科学基金委、生命科学联合中心、北京生物结构前沿研究中心等的资金支持，并得到了国家蛋白质科学研究（北京）设施清华基地的设备和技术支持。