精准基因敲入是基因治疗与细胞治疗领域的重要底层技术，具有广阔的临床应用前景。在基因治疗中，将功能性基因精准整合至患者特定基因组位点，有望实现持久的基因功能恢复；而在肿瘤免疫治疗，如CAR-T细胞工程化改造过程中，将识别肿瘤的CAR序列定点整合至原代T细胞基因组中，可以降低病毒载体随机整合带来的潜在风险。然而，传统基于CRISPR-Cas9的基因敲入技术依赖DNA双链断裂（DSBs），通常伴随较高的非预期插入/缺失突变（indels）、染色体易位以及脱靶编辑等风险，并可能影响基因组稳定性，增加长期安全性风险。因此，如何在不产生DSBs的情况下实现大片段DNA的高效、精准整合，成为基因编辑领域长期关注的重要科学问题。

7月22日，清华大学生命科学学院王海峰课题组在《自然》（Nature）杂志上发表题为“无需双链断裂的高效精准可编程DNA敲入”（Efficient and precise programmable DNA knock-in without double-strand breaks）的研究论文。该研究开发了一种新型CRISPR基因编辑工具KNIT Editing（kilobase-scalenickase-targeting editing，千碱基尺度切口酶靶向编辑，KE）。该技术只在DNA的一条链上制造切口，在不产生DNA双链断裂的情况下，实现千碱基规模DNA片段的高效、精准插入，效率最高可达89%，最长插入片段超过10 kb，有望为基因治疗和细胞治疗提供更安全的技术平台。

研究团队围绕Cas9切口酶（Cas9nickase，一种仅切割DNA单链的Cas9变体）介导的基因敲入策略，系统评估了融合DNA修复调控因子、NHEJ通路抑制剂以及富集供体模板等多种优化策略，发现将供体DNA富集至单链切口附近是提升单链切口介导精准插入效率的关键因素，并据此开发了KNIT editor 1（KE1）基因编辑系统：利用Cas9切口酶产生DNA单链切口并招募供体DNA至编辑位点附近，通过近邻增强的单切口HDR过程实现了精准高效的DNA插入（图1a）。在此基础上，团队进行了第二轮筛选，开发了升级版KNIT editor 2（KE2），通过多价供体招募策略进一步提高了插入效率（图1b，c）。

图1. KNITEditing策略示意图及结果

研究表明，KE编辑系统在多种细胞类型和多个基因组位点均具有优异表现，支持从约0.7 kb到超过10 kb的大片段DNA序列精准整合，插入效率最高可达89%。与此同时，该技术显著降低了indels、染色体易位和脱靶编辑等非预期编辑事件，大幅提升了基因编辑的准确性和安全性。除高效定点插入外，KE还具备重复编辑和多位点同时编辑能力。由于单链切口很少产生indels，未完成插入的细胞仍保留完整靶序列，从而可接受后续再次编辑，提高总体编辑效率。此外，在多位点同时编辑时，KE产生的染色体易位也明显少于基于DSBs的方法，展现出良好的多位点编辑能力。

为验证其应用潜力，研究团队进一步将KE用于遗传疾病相关基因修复。在携带溶酶体酸性脂肪酶缺乏症（LAL-D）相关的LIPA基因致病突变的细胞模型中，研究人员利用KE将正常LIPA的cDNA插入AAVS1“安全港”位点或其天然基因位点，恢复了野生型LIPA的表达，验证了该技术在遗传病治疗中的应用潜力。

KE还可以应用于无病毒、无DSBs的CAR-T细胞制备。作为极具前景的肿瘤免疫治疗方法之一，CAR-T疗法亟需兼具高效率和高安全性的基因整合技术。研究团队在临床广泛关注的TRAC位点实现了CAR元件的高效整合，平均敲入效率达到32.9%，最高达到40.6%，同时减少了indels、染色体易位和脱靶插入。利用KE制备的CAR-T细胞不仅保持了良好的增殖能力和功能状态，还在体外肿瘤细胞杀伤实验及荷瘤小鼠模型中表现出显著的抗肿瘤活性。

综上，该研究通过系统筛选发现，供体DNA与编辑位点的空间邻近是限制单链切口介导HDR效率的关键瓶颈，并据此建立了KE基因编辑平台。作为一种无DNA双链断裂、无需病毒载体、无需外源DNA修饰酶即可实现大片段DNA精准整合的新型编辑技术，KE兼具高效率、高精度和高安全性，不仅适用于多位点基因编辑，还在遗传病治疗和CAR-T细胞开发等领域展现出应用潜力，有望助力基因治疗和细胞治疗产品开发，为精准医学的发展提供技术支撑（图2）。

图2. KNIT Editing技术优势及应用前景

王海峰副教授为本文的通讯作者；清华大学生命科学学院博士后郜艳敏、2021级博士生马宇、2022级博士生于可欣和北大-清华-北生所联合培养2021级博士生刘印天为共同第一作者。

研究工作得到农业农村部项目、国家重点研发计划、国家自然科学基金、清华大学自主科研计划、疑难重症及罕见病全国重点实验室自主研究课题、清华-北大生命科学联合中心和本源公益基金等项目的支持。