清华新闻网12月9日电 咳嗽是一种重要的呼吸道防御性反射，能够清理呼吸道的异物及入侵病原，同时，咳嗽也是众多呼吸道疾病如哮喘、新冠病毒感染后遗症等的共同症状之一。虽然咳嗽是保护呼吸道的重要反射，但是在病理状态下，咳嗽反射被过度激活，引发慢性咳嗽，当前的治疗策略难以根除，极大地影响了患者的生活质量。目前，大部分研究咳嗽的工作主要使用豚鼠、猫等动物，繁殖成本高且缺乏有效的遗传工具，使用小鼠作为实验动物能为咳嗽研究提供更多的可操控遗传工具。然而，目前阶段仍未有能在小鼠上清晰地分辨出咳嗽行为的范式。此外，咳嗽的中枢环路机制至今空白，解析控制咳嗽的中枢环路或能为理解慢性咳嗽的病理机制提供新思路。

近日，清华大学生物医学交叉研究院曹鹏实验室在《创新》（The innovation）杂志在线发表了题为“脑干阿片类肽能神经元调节小鼠的咳嗽反射”（Brainstem opioid peptidergic neurons regulate cough reflexes in mice）的研究论文。该研究开发了一种崭新的三通道咳嗽行为范式，能同时监测小鼠胸膜内压（Intrapleural pressure，IPP）、腔内气流（Boxflow）及超声（Ultra sound），并区分出咳嗽和打喷嚏两种截然不同的呼吸道防御性反射，同时使用该行为范式，发现了小鼠孤束核（NTS）中的一群向呼吸中枢cVRG的谷氨酸能神经元投射的特异性的强啡肽能（Pdyn）神经元对咳嗽反射至关重要。

研究人员首先开发了一套可定量分析小鼠咳嗽的行为范式：通过使用全身体积扫描仪（whole-body plethysmography，WBP）、体内植入遥测装置、超声麦克风，可实时监测小鼠所在腔体的气流波动（Boxflow）、胸膜内压（IPP）及细微声音变化（Sonogram）。在该系统中使用辣椒素成功诱导出Class I 和Class II两种声音频率、时长截然不同的气道防御性反射。由于NG和TG的神经末梢分别大量支配着喉部和鼻腔黏膜，研究人员随后使用化学遗传抑制病毒（hM4Di）分别/同时抑制支配呼吸道的NG和TG中的Trpv1⁺神经元，分别/同时抑制了Class I 和Class II反射，并分辨Class I为咳嗽反射。

利用辣椒素刺激FosTRAP2小鼠，研究人员定位到dorsal vagal complex（DVC）脑区响应辣椒素引发的生理性咳嗽，通过对NTS的FISH染色，发现三种啡肽类物质（强啡肽prodynorphin，脑啡肽proenkephalin，内啡肽proopiomelanocortin）特异性表达在DVC，通过化学遗传抑制DVC中的Pdyn，Penk及Pomc神经元。其中，Pdyn⁺神经元抑制能显著减少辣椒素或柠檬酸引发的咳嗽。

同时，研究人员对Pdyn-Cre小鼠的NTS脑区注射AAV-DIO-GCaMP并包埋光纤，利用光纤记录手段，研究人员发现小鼠的呼吸与GCaMP信号存在偶联且咳嗽能大幅度引起Pdyn⁺NTS神经元GCaMP信号上升，但是打喷嚏则对Pdyn⁺NTS神经元GCaMP信号无明显影响，为了进一步确定Pdyn⁺NTS神经元与咳嗽相关的GCaMP信号是否由外周的Trpv1⁺迷走神经传入，研究人员使用单侧迷走神经截断术或Trpv1-KO小鼠进行Pdyn⁺NTS神经元的光纤记录实验，发现单侧迷走神经截断术或Trpv1的敲除，均能减弱咳嗽引发的Pdyn⁺NTS神经元GCaMP信号的上升，从而确认了Pdyn⁺NTS神经元接收来自Trpv1⁺迷走神经的信号输入并响应咳嗽。

为了进一步验证Pdyn⁺NTS神经元的激活是否是引发咳嗽的充分条件，研究人员对Pdyn-Cre小鼠NTS脑区双侧注射了AAV-DIO-hM3Dq，使用化学遗传学手段激活Pdyn⁺NTS神经元，结果表明，这群神经元的激活能有效引起咳嗽且不改变小鼠的呼吸速率，由此激发的咳嗽各类指标与辣椒素诱发的咳嗽一致。此外，研究人员对Pdyn-Cre小鼠的NTS脑区注射AAV-DIO-ChR2并包埋光纤，光激活Pdyn⁺NTS神经元同样能有效地诱发咳嗽。这些结果表明，Pdyn⁺NTS神经元的激活对诱发咳嗽反射是充分条件。

为了探究Pdyn⁺NTS神经元的下游通路，研究人员对Pdyn-Cre小鼠NTS脑区注射AAV-DIO-EGFP-Syb2，发现EGFP⁺的末梢主要出现在cVRG及同侧中间网状核（IRt）。为确定Pdyn⁺NTS-cVRG和Pdyn⁺NTS-IRt在咳嗽反射中的作用，研究人员在Pdyn-Cre小鼠NTS脑区注射AAV-DIO-hM4Di并在cVRG或IRt包埋给药管，通过精准脑区递送CNO抑制来自Pdyn⁺NTS的信号，结果发现Pdyn⁺NTS-cVRG的抑制能有效减少辣椒素诱发的咳嗽，表明Pdyn⁺NTS-cVRG环路功能对咳嗽反射是必要的。为进一步确定Pdyn⁺NTS-cVRG环路在咳嗽反射的功能，研究人员对Pdyn-Cre小鼠的NTS注射AAV-DIO-ChR2并在cVRG包埋光纤，结果表明光激活NTS-cVRG的末梢能稳定地引发咳嗽反射。此外，研究人员对WT小鼠的cVRG注射AAV-ChR2-EYFP并包埋光纤，直接对cVRG的激活也能稳定地引发咳嗽反射。接下来，研究人员研究了Pdyn⁺NTS cVRG通路是否与咳嗽相关肌肉通过突触连接。为了验证这一点，研究人员将AAV-DIO-EGFP-Syb2注射到Pdyn IRES Cre小鼠的DVC中，并将表达dsRed的伪狂犬病毒（PRV）注射到横膈膜、肋间肌和腹部肌三个肌肉群中，实现dsRed+神经元在几个大脑区域逆行标记。在cVRG中，dsRed+神经元与源自Pdyn⁺NTS神经元的EGFP-syb2+轴突末梢相互分散。这些形态学结果表明，Pdyn⁺NTS cVRG通路可能通过跨突触调节咳嗽相关肌肉，进而调控咳嗽反射。

综上所述，研究开发了一种三通道监测的小鼠咳嗽行为范式，并以此范式揭示了一条调控咳嗽反射的特异性环路：Pdyn⁺NTS-cVRG，为后续咳嗽的深层神经机制研究奠定重要基础。

三通道监测的小鼠咳嗽行为范式

清华大学生物医学交叉研究院高级研究员曹鹏为论文通讯作者。曹鹏实验室2022级TIMBR博士生卢海成、2022级PTN博士生郑文萱，博士后陈国庆、赵淼、谷华婷、黄美珠，首都医科大学硕士生李夏婷为论文共同第一作者。研究得到北京市科委、清华大学生物医学交叉研究院以及北京生命科学研究所的资助。