多巴胺作为最重要的神经递质之一，在生物体调控奖赏、成瘾、学习记忆以及运动等生理功能中发挥着至关重要的作用。多巴胺系统的失调与帕金森、精神分裂症等多种精神疾病密切相关。对多巴胺高时空分辨率、高灵敏特异的检测对进一步理解其在各种生理和病理条件下的作用具有十分重要的意义。北京大学生命科学学院李毓龙教授课题组在2018年报道了第一代的绿色多巴胺探针DA1m和DA1h（Fangmiao Sun et al., Cell, 2018），并于2020年发表了第二代的绿色多巴胺探针DA2m、DA2h和红色多巴胺探针rDA1m、rDA1h（Fangmiao Sun et al., Nature Methods, 2020）。虽然这些探针已能满足对于多巴胺神经元密集投射的脑区（如纹状体和伏隔核）内多巴胺的灵敏检测，但对投射稀疏的前额叶皮层、杏仁核等脑区内多巴胺的检测却十分困难。此外，第一代红色多巴胺探针整体的反应幅度、灵敏度以及特异性都有待进一步提升。

12月1日，李毓龙课题组在Nature Methods杂志在线发表题为“Improved green and red GRAB sensors for monitoring dopaminergic activity in vivo”的研究论文，开发了第三代的红绿双色多巴胺探针工具包，并通过在体红绿双色成像等方式证明全新一代多巴胺探针在多脑区、多行为范式下均能灵敏特异地检测多巴胺及其它信号分子的时空动态释放。

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李毓龙课题组基于GRAB探针策略 (GPCR-Activation Based Sensor)，已先后开发针对胆碱类、单胺类、嘌呤类、脂类和神经肽类神经递质/调质的荧光探针。近日，该团队在Science上报道了一种全新、高效、通用的荧光报告模块嫁接策略，并开发出一系列神经肽荧光探针（Huan Wang et al., Science, 2023）。研究人员基于相似策略，将含有荧光报告基团模块的ICL3从现有的神经递质探针中移植到多种不同物种的多巴胺受体中，从而开发出一系列全新一代多巴胺探针，包括绿色第三代多巴胺探针gDA3m、gDA3h及红色第二代多巴胺探针rDA2m、rDA2h、rDA3m和rDA3h。

研究人员在哺乳动物细胞和原代培养神经元内对这一系列多巴胺探针的性能进行刻画比较，发现全新一代红绿多巴胺探针无论在反应幅度、灵敏度和选择性上都显著优于现有的多巴胺探针。在急性脑片电刺激实验中，gDA3m和rDA3m探针不仅可靠报告了多巴胺释放的动态变化，还忠实保留了受体骨架本身的药理学特性。在体的光遗传学激活实验也发现，这一系列全新多巴胺探针能灵敏、特异地刻画多巴胺的动态释放。

为进一步确认新一代红色多巴胺探针的在体检测能力，作者将rDA3m和绿色cAMP探针GFlamp1共表达在小鼠伏隔核脑区，并用光纤记录探测多巴胺以及下游神经元胞内信号分子cAMP在雄鼠交配行为过程中不同阶段的动态信号变化，发现了多巴胺及其下游信号cAMP动态变化的一致性。此外，作者将rDA3m和乙酰胆碱探针ACh3.0共表达在小鼠的前额叶皮层和伏隔核，并利用光纤记录的方式记录在巴普洛夫条件学习中，小鼠在奖赏和厌恶刺激条件下两个脑区两种神经递质在不同训练时期的动态变化。通过双光子成像实验，作者进一步精确观测到在跑步、尾部电刺激和声音刺激等不同条件下M1/M2皮层中gDA3h的时空动态变化。

综上所述，这项研究利用新型ICL3嫁接策略，构建了全新一代的红绿双色多巴胺探针工具包。与已发表的多巴胺探针相比，全新一代多巴胺双色探针具有更高的反应幅度、更好的灵敏度和更特异的选择性，使得在体双色光纤记录多种神经递质分子在多个脑区不同行为下的动态变化及皮层双光子成像成为可能。因此，该研究开发的全新一代多巴胺探针弥补了现有多巴胺探针的短板，对于中枢神经系统不同脑区的多巴胺都能实现灵敏、特异的检测，为进一步深入研究多巴胺系统在生理和病理条件下的作用和分子机理提供了更为强大的工具。

李毓龙为该论文的通讯作者；北京大学生命科学学院博士生卓一洲、博士后罗斌为该论文的共同第一作者；北京大学已毕业本科生易馨阳，北京大学副研究员董辉、赵玉琳，北京朝阳医院苗晓蕾，北京大学博士后万金霞，博士研究生蔡儒仪、王蕾、王欢和郑宇等为该论文作出重要贡献。该工作得到哈佛大学Mitsuko Watabe-Uchida实验室、中国科学院深圳先进技术研究院朱英杰实验室、俄勒冈健康科学大学John T. Williams 实验室和Marina E. Wolf实验室的通力合作；国家自然科学基金、国家重点研发计划、北京市科委、北京大学膜生物学国家重点实验室、北大-清华生命科学联合中心、深港脑科学创新研究院、峰基金、新基石科学基金会所设立的新基石研究员项目与科学探索奖等机构和经费的大力资助和支持。