2026年7月27日，北京大学现代农学院、基因功能研究与操控全国重点实验室杨建国课题组在Nature Communications上发表了题为“A decoupled transcription platform enables tunable and predictable gene expression in yeast”的研究成果。该研究建立了一套全新的真核表达体系，能够在真核细胞中实现多基因通路的快速优化，为包含固氮酶系统在内的复杂多基因通路在真核细胞中的协调表达提供了高效的工具。

论文截图

复杂代谢通路在异源底盘中的功能性重构，是赋予生物体新表型及合成高附加值产物的核心策略。然而，在真核细胞底盘内实现多基因复杂通路的协同表达，目前主要依赖内源或合成启动子文库来分级调控各基因的转录强度。但实践表明，启动子在单基因测试环境下的强度排序，在多基因组合表达时往往发生紊乱，甚至出现“强弱倒置”的不可预测现象；更关键的是，启动子序列与目标基因的表达水平在DNA层面高度耦合，一旦需要调整某一基因剂量，往往必须重新设计、构建并验证整套表达元件，这不仅显著延长了通路的优化周期，也大幅推高了实验成本。以固氮酶系统的异源重构为例，该系统因基因数量繁多且各组分间需维持严格的化学计量比方能发挥功能，天然复杂性使其在真核乃至作物细胞中的推进尤为艰难。针对上述真核底盘多基因协调表达的普遍性瓶颈，杨建国课题组以酿酒酵母为模式底盘，开发了基于CRISPRa的正交多基因定量表达系统——CAPO（CRISPR-Activated Promoter based Orthogonal quantitative expression system）。该系统有效突破了真核底盘中启动子强度不稳定、组合表达不可预测及元件重复构建代价高昂等关键难题，为复杂异源代谢通路及多基因功能模块在真核细胞中的工程化设计，提供了一种兼具模块化与可扩展性的新型平台。

CAPO系统工作原理示意图

在CAPO系统的设计中，作者首先基于真核启动子的结构特征，将其近端调控区替换为特异性gRNA结合位点，同时保留核心启动子元件，构建了仅受dCas9-VPR融合转录激活蛋白激活的合成型CRISPR激活启动子（CAP，CRISPR-Activated Promoter），从而实现了转录激活机制与启动子固有架构的解耦，使启动子本身成为可被gRNA精准调用的正交表达元件。针对多基因并行表达中不同gRNA结合亲和力可能引起的输出偏差，作者进一步开发了T7驱动CRISPR激活启动子筛选策略（T7DCAP），借助双荧光报告体系快速筛选并校准功能等效的gRNA，以提升各调控模块间的输出稳定性。在此基础上，构建了具有分级转录能力的T7启动子突变体文库，实现了对gRNA转录通量的连续调控。与传统“启动子-基因”一体化调控模式不同，CAPO将目标基因表达强度的调节转移至独立的gRNA表达模块，使得同一套CAP启动子和目标基因构建可在不同表达水平下重复调用。这一设计显著降低了多基因系统优化过程中的DNA构建复杂度，并为多个功能基因的比例控制提供了统一且模块化的调控框架。系统表征结果表明，优化后的CAPO平台具备高转录激活效率、极低的本底泄漏以及良好的表达梯度可预测性；其输出覆盖宽广的转录表达范围，且在不同外源基因之间保持稳定一致的强度排序，有效缓解了传统真核表达系统中常见的启动子强度倒置问题。基于三色荧光报告模型，CAPO实现了多基因表达比例的精细编程，验证了其在复杂表型协调调控中的适用性。在代谢工程应用中，作者将CAPO系统用于番茄红素和3-羟基丙酸合成通路的快速优化，通过分级gRNA组合筛选显著提升了目标产物积累水平，并进一步在同一酵母底盘内实现了两条异源代谢模块的正交独立激活，展现出CAPO在多通路并行构建和工程化开关控制方面的应用潜力。

RGB三色荧光报告模型验证CAPO系统的表达谱

综上所述，CAPO系统将CRISPRa的可编程激活优势与T7转录体系的正交调控特性有机结合，为真核细胞中多基因网络的定量设计、代谢通路优化以及复杂合成生物系统的构建提供了一种高效、模块化且可扩展的新型表达平台。未来，该技术有望服务于固氮酶系统等复杂生物功能模块在真核底盘中的重构，为合成生物学驱动的绿色农业与生物制造提供关键工具支撑。

杨建国为本论文的通讯作者，前沿交叉学科研究院2022级PTN项目博士生陈昱杰和现代农学院博士后李辉（已出站）为论文的共同第一作者。现代农学院博士生段霖和陈昊洋、前沿交叉学科研究院博士生刘阳以及海南大学食品科学与工程学院燕靖睿同学参与了本研究。该研究得到了农业生物育种国家科技重大专项、国家重点研发计划项目、国家自然科学基金、基因功能研究与操控全国重点实验室以及北京大学现代农学院的资助。