光学显微镜的分辨率受到衍射极限的限制，只能达到~200 nm的分辨率。在最近20年中，STED、SIM、PALM/STORM、DNA-PAINT等一系列技术，通过点扩展函数（point spread function, PSF）的调制，突破了光学衍射的限制，使光学分辨率最低达到20nm，得到广泛的生物应用并获得2014年的诺贝尔化学奖。

2017年，诺贝尔奖得主Stefan Hell（STED技术的发明人）发展了MINFLUX技术（MINimal photon FLUXes，最低光子数显微成像），并将其称为“后诺贝尔奖时代的显微技术”。MINFLUX进一步提升了光学分辨率，可以获得~1 nm的定位精度和~5 nm的空间分辨率。MINFLUX作为单分子定位技术，结合了STED与STORM两种技术的特点。与STED的淬灭光使用甜甜圈（donut）形状的中空光斑不同的是，MINFLUX使用donut光斑作为激发光；类似GPS定位的原理，MINFLUX使用甜甜圈光斑对荧光分子进行多次激发，进而可以通过统计学方法，估计出荧光分子的位置。

1 nm的定位精度已经与单个分子的大小十分接近。但定位精度不等于光学分辨率，分辨率并没有达到~1 nm的尺度，仍有提升的空间。是否有新的方法，可以进一步提升光学显微镜的分辨率呢？

北京大学的席鹏教授实验室从理论上证明了，将双光子激发（two-photon excitation, TPE）用于MINFLUX技术中，可以再将定位精度和分辨率提高2倍，获得小于1 nm 的定位精度。该结论以“Two-photon MINFLUX with doubled localization precision”为题，发表于最新一期的eLight期刊。文章结果显示，双光子MINFLUX（Two-photon MINFLUX, 2p-MINFLUX）不仅可以提升2倍的定位精度，同时可以具有更为直接的多色成像潜力。

该工作得到了超分辨权威专家FernandoStefani教授课题组的点评，以“Multiphoton single-molecule localization by sequential excitation with light minima”为题发表于Light: Science & Applications。点评指出，该工作为多光子效应引入MINFLUX技术以及为今后MINFLUX应用于深层生物成像和实现更高定位精度提供了前瞻性理论基础。

MINFLUX的技术原理关键在于，donut光斑零点附近的梯度，远高于高斯光（Gaussian beam）顶点附近的梯度。MINFLUX使用donut零点附近进行定位，即可降低定位所需光子数量、提高定位精度。文章指出，由于双光子激发的非线性效应，荧光强度正比于激发光强度的平方，于是donut零点附近的梯度将被进一步提高（图1）。对比2p-MINFLUX和传统MINFLUX，在采集到同样荧光光子数的条件下，2p-MINFLUX理论上可以获得2倍的定位精度提升；若为获得同样定位精度，2p-MINFLUX只需要1/4的光子数即可实现。

图1直观对比和展示了2p-MINFLUX和现有1p-MINFLUX成像过程和结果。一方面，在2p-MINFLUX和1p-MINFLUX采集到同样荧光光子数的条件下，1p-MINFLUX无法分辨的结构，可由2p-MINFLUX分辨（图1b、c）。另一方面，在2p-MINFLUX和1p-MINFLUX达到同样定位精度时，2p-MINFLUX只需要1p-MINFLUX的1/4的光子数（图1c、d）。