近日，中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所原生动物学团队高珊课题组在Cell Press细胞出版社旗下Trends in Genetics（《遗传学趋势》）发表综述文章“Sequence-independent 6mA methyltransferases for epigenetic profiling and editing”（无序列偏好性的6mA甲基化酶在表观遗传分析与基因编辑中的应用），系统梳理了外源6mA标记技术与三代长读长测序相结合在染色质图谱绘制、蛋白质—DNA互作定位和靶向表观遗传编辑方面的应用，着重分析了其方法学优势，并就当前技术瓶颈和优化前景展开讨论。

6mA作为一种新兴的表观遗传标记，广泛分布于原核生物和低等真核生物，在高等真核生物中含量稀少，这为利用6mA甲基化酶进行染色质标记提供了更低的背景。无序列偏好性的6mA甲基化酶EcoGII和Hia5催化活性高且底物范围广，已成为6mA表观遗传工程领域的核心工具。近年来，以Pacific Biosciences和Oxford Nanopore Technologies为代表的第三代测序技术，分别通过监测DNA聚合酶动力学扰动和离子电流变化，实现了对DNA甲基化修饰的单碱基分辨率直接检测（图1A）。相比二代测序，三代测序无需PCR扩增和DNA片段化处理，可直接检测表观遗传标记并真实地反应单分子异质性，同时克服了二代测序在序列高度重复区域和结构复杂区域的多重比对问题（图1B）。

通过将6mA甲基化酶和三代测序技术相结合，可实现单分子、单碱基分辨率下的染色质状态解析，包括核小体占位情况、核小体缺失区域及转录因子结合位点的高精度检测（图2）。目前该技术已在玉米和人类脑组织等多个体系中得到了应用，虽仍受限于测序成本、细胞需求量和酶学条件等制约，但随着测序价格下降以及酶工程和CRISPR富集技术发展，6mA甲基化酶有望成为绘制高分辨染色质图谱和开展表观诊断的重要工具。

图1 三代测序能够在复杂区域进行DNA甲基化检测

图2 利用6mA甲基化酶和三代测序绘制染色质环境图谱

在解析蛋白质—DNA相互作用方面，DiMeLo-seq等技术通过抗体识别目标蛋白，招募融合protein A的EcoGII或Hia5，在目标蛋白或组蛋白修饰位点附近特异性引入6mA标记，随后借助三代测序技术，可直接在单分子水平获得蛋白结合的位点信息，并可在序列高度重复的着丝粒和亚端粒区域检测到新的蛋白互作位点。然而，抗体介导的非共价结合稳定性有限，后续可以引入纳米抗体或采用共价偶联策略增强复合物稳定性，从而进一步提升标记效率与位点解析的可靠性。

在靶向表观基因编辑方面，将METTL4等6mA甲基化酶与dCas9融合表达，可在多种细胞中实现位点特异性6mA添加，再招募6mA识别蛋白与转录效应因子，能够实现精确的转录调控。值得注意的是，EcoGII和Hia5由于其序列限制更弱，是构建6mA编辑工具的理想底盘，但需要通过载体设计、定向突变等方式优化其活性，从而降低脱靶效应。 

高珊教授（后排左三）和论文第一作者张佳晨（后排左一）、张雨苗（前排右一）

该文章由中国海洋大学进化所原生动物学团队高珊教授课题组撰写。高珊教授课题组博士生张佳晨和张雨苗为该文章的共同第一作者，高珊教授为文章的通讯作者。高珊教授课题组博士生刁静涵和美国南加州大学刘一凡副教授对本文亦有重要贡献。研究工作得到国家自然科学基金、山东省自然科学基金、崂山实验室科技创新项目和中央高校基本科研业务费等资助。