近日，上海交通大学王平课题组开发了一种新型邻近驱动蛋白连接策略IEDDA （IAN，IEDDA-assisted Native Chemical Ligation），依托光可裂解甲基吡啶（Pic）连接子与超快生物正交反应，实现了在极低浓度条件下的高效蛋白连接，为大分子、疏水蛋白低成本、温和条件合成提供通用化学工具。

   化学蛋白合成可制备重组表达无法获得的带特殊翻译后修饰蛋白，是化学生物学核心技术。但传统的天然化学连接方法反应动力学受限，必须使用毫摩尔级高浓度肽段才能实现有效偶联；而分子量较大、疏水性强的蛋白仅在微摩尔稀溶液中稳定，高浓度下极易聚集沉淀，大幅降低合成成功率。其次，现有低浓度辅助连接策略需要在固相多肽合成阶段提前引入，无法对体外表达蛋白进行后期修饰，与表达蛋白连接（EPL）技术不兼容；且辅基脱除需三氟乙酸、高强度紫外等苛刻条件，易破坏蛋白敏感修饰基团。

图1. 研究背景

   交大研究团队基于前期开发的甲基吡啶（Pic）光控修饰骨架，构建携带四嗪（Tz）、双环壬炔（BCN）两种反应基团的光可裂解 Pic 连接子，通过IEDDA快速点击反应，将两个蛋白片段“锁定在局部高有效浓度空间”，再触发NCL反应完成连接。搭建 IAN 全新合成策略。

图2. IEDDA-assisted Native Chemical Ligation（IAN）策略的建立

   在模型反应中，作者系统评估了IAN策略在不同浓度条件下的反应效率，建立了“IEDDA点击 → NCL连接 → 光脱连接基元“三阶段级联反应体系，该策略可在25 μM超低浓度条件下，仍保持高效率反应（93%），显著突破了传统多肽连接策略对浓度的依赖。与此同时，对照实验中，传统NCL反应在0.2 mM条件下产率接近零。这一结果表明，作者发展的IAN策略显著降低了蛋白连接对浓度的依赖，实现了低浓度体系中的高效偶联。

图3. IAN策略用于不同间距及连接位点的多肽合成

   为验证该策略的适用范围，研究团队进一步构建了多种不同结构背景的底物体系。首先，作者系统考察了Tz与BCN连接位点之间的间距影响，结果表明：即使连接位点间距扩展至29个氨基酸残基，体系仍可保持约95%产率，说明该策略对蛋白柔性构象具有较强适应能力。随后，作者进一步将体系扩展至不同C端硫酯肽，尤其是具有明显空间位阻的Val与Ile硫酯肽。结果显示，在IAN策略下，所有目标肽段均可高效生成，而在对照NCL体系中几乎无法检测到目标产物。这一系列结果表明，作者发展的IAN策略能够有效克服传统NCL对位阻敏感的问题，具有更广泛的底物适用性。

同时，该策略修饰灵活，可后期修饰合成肽与表达蛋白

Tz/Pic、BCN/Pic 两类连接子可在蛋白 / 肽合成完成后，靶向修饰半胱氨酸巯基，实现定量偶联；同时突破半胱氨酸数量限制，修饰位点可拓展至赖氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸等十多种氨基酸侧链，底物适用范围极广。

超快生物正交反应构建邻近效应，大幅提升局部有效浓度

利用逆电子需求狄尔斯 – 阿尔德（IEDDA）反应 —— 水溶液中二级速率常数高达 10? M?1s?1，能快速将两条蛋白片段拉近，依靠分子内邻近效应消除稀溶液带来的动力学障碍，实现微摩尔浓度高效连接。

全流程温和水相，一锅三步无需中间提纯

整套反应在水溶液中连续完成，无需分步分离纯化：第一步 IEDDA 快速偶联拉近蛋白链；第二步开展天然化学连接 / 表达蛋白连接形成天然酰胺键；第三步可见光催化无痕脱除 Pic 连接子，仅需 20W 普通荧光灯、弱酸性环境 20 分钟即可完全清除辅基，无残留修饰损伤蛋白结构；整套体系还可同步兼容自由基脱硫反应，进一步拓宽连接位点。

作者选择G-CSF（174 amino acids）作为目标蛋白，将其拆分为表达蛋白片段与合成肽段，并在50 μM低浓度条件下实现高效连接，成功获得全长G-CSF蛋白。

图4. IAN在难溶蛋白（G-CSF）合成中的应用

随后，作者进一步将该策略扩展至SARS-CoV-2 spike protein RBD片段，实现表达蛋白片段之间的高效连接，成功构建嵌合蛋白体系。值得注意的是，在相同条件下，传统NCL方法在低浓度体系中无法实现有效连接，进一步凸显了IAN策略在表达蛋白化学合成中的优势。

图5. IAN辅助嵌合蛋白G-CSF-RBD的合成

IAN 策略实现固相合成肽 + 体外表达蛋白通用适配，彻底打破低浓度蛋白合成的技术壁垒。整套工艺条件温和，不会破坏蛋白翻译后修饰，一锅式简化操作流程，大幅降低大分子、疏水蛋白合成门槛。相关成果以“Proximity-Driven Protein Ligation Beyond the Concentration Limit”发表于《Journal of the American Chemical Society》上。上海交通大学博士生尹建辉和博后刘新亮为共同第一作者，王平教授和叶发荣助理研究员为通讯作者。