在过去二十年间，我国不孕不育率已经从百分之三急升至百分之二十。随着科技进步和相关费用纳入医保，辅助生殖技术（俗称“试管婴儿”技术）日益普及并成为不孕不育的主要治疗手段。但是，目前其效率依然受限，其中最大的瓶颈在于高达一半的人类胚胎在首五天发育过程中会发生停滞，无法用于移植。常规技术如多组学只能对已经停滞的胚胎进行单节点分析，无法回顾和溯源停滞前所发生的生物学事件，要阐明停滞的成因并针对性开发防治方案亟待新型技术的开发。

6月11日，北京生命科学研究所（北生所）/清华大学生物医学交叉研究院苏俊研究员、中南大学/中信湘雅生殖与遗传专科医院林戈研究员、北京家圆医院徐小明副研究员、中国科学院动物研究所王红梅研究员、广东智慧医学国际研究院杨云研究员合作在《细胞》（cell）杂志发表题为“人类着床前发育低效的两个成因”（Two distinct causes contribute to the low efficiency of human pre-implantation development）的研究论文。该研究通过国际领先的荧光活细胞显微成像技术首次实现了人类胚胎着床前全五天发育的“高清”拍摄。

图1.哺乳动物卵子和着床前胚胎发育显微成像技术的发展历程

研究人员系统分析了超过150枚人类和食蟹猴胚胎中2000多次的卵裂，明确了早期（前三天）和晚期（第四天）的胚胎停滞是由两种截然不同的机制所驱导。该发现促使了针对早期胚胎停滞的高效小分子抑制剂的筛选，相关成果已申请国际专利并计划进行临床转化。

图2.研究阐明了人类着床前胚胎停滞的成因

受光毒性限制，常规的显微成像技术如共聚焦或双光子只能对人胚进行24-48小时的连续观察，未能完全覆盖从受精至着床前囊胚形成所需要的120小时。为此，苏俊于三年前在北生所搭建了全球第一台高通量双视野活细胞光片显微镜。结合新一代的荧光活细胞化学探针和优化的图像处理算法，可以在不影响人胚发育的前提下以12分钟的间距和3003002000纳米的体数大小进行深度达300微米的长时程荧光活细胞显微成像。

图3.人类胚胎着床前全五天发育的显微成像

在北京家圆医院、中南大学/中信湘雅生殖与遗传专科医院和中国科学院动物研究所的支持和相关伦理委员会的监管下，研究人员利用人补救性体外成熟卵子、人体内成熟卵子和食蟹猴体内成熟卵子分别制备了人R-IVM来源、人IVO来源和食蟹猴IVO来源的受精卵。通过比较人R-IVM和IVO来源的受精卵，可以排查卵子质量相关的影响；通过比较人IVO和食蟹猴IVO来源的受精卵，可以排查物种差异相关的影响。

图4.着床前胚胎长时程荧光活细胞成像的技术路线

胚胎在首五天发育经历多次卵裂。在微管细胞骨架组装的双极纺锤体的作用下，染色体正常会被平均分配到两个子细胞，继而形成两个新的细胞核。可是，如果胚胎细胞组装了异常的多极纺锤体，就会引发染色体排列错误、染色体分离错误、多极分裂等卵裂异常，最终形成染色体异常的胚胎细胞。

图5.人类胚胎细胞的纺锤体与卵裂异常

受材料限制，过往基于其他物种受精卵和临床废弃的受精异常人受精卵的研究普遍认为哺乳动物胚胎在精子和卵子刚结合后的第一次卵裂中最容易出错。令研究人员意外的是，人和食蟹猴胚胎首五天发育的纺锤体异常率和卵裂异常率均呈现与发育阶段相关的高度异质性，其发生率在第一次卵裂（一细胞阶段）仅为5%，但在第二次卵裂（二细胞阶段）会急升至30%-45%，随后在第三次卵裂（四细胞阶段）又回落至5%，继而逐渐下降至正常体细胞的水平（1%）。

图6.（A）人和食蟹猴不同来源胚胎前三天的纺锤体异常（B）人IVO来源胚胎前五天的纺锤体异常

为了探明纺锤体异常在人胚二细胞阶段高发的原因，研究人员聚焦到细胞里的经典微管细胞骨架组织中心——中心体。中心体在人类卵子的发育过程中退化，但是精子所携带的两个中心粒会促使中心体在受精卵里重新形成。通过中心体计数、激光消融、显性失活突变体和孤雌激活等一系列实验，研究人员明确了中心体对着床前胚胎的纺锤体组装有着绝对的必要性，且其数目异常能直接诱导异常纺锤体的发生。研究人员继而发现人胚在二细胞阶段首次复制中心体时出错率同样为约40%。基于此发现，通过在二细胞阶段短暂加入半抑制浓度的中心体复制关键调控激酶PLK4抑制剂centrinone，成功阻止胚胎中心体复制错误的发生。

图7.（A）人一细胞和二细胞阶段胚胎的中心体计数（B）Centrinone处理的人一细胞和二细胞阶段胚胎的中心体计数（C）二细胞阶段处理Centrinone后的人四细胞阶段胚胎

通过分析长达五天的胚胎发育动态并进行单细胞追踪，研究人员发现超过70%的前三天停滞胚胎在二细胞阶段均发生了纺锤体异常，且前三次卵裂中只有第二次卵裂的异常能预测人着床前胚胎发育的结局。在此基础上，研究人员进一步通过一系列的实验与分析建立了纺锤体异常、染色体异常和胚胎细胞细胞周期停滞之间的关系，至此阐明了人着床前胚胎早期停滞的机制。

图8.（A）人胚胎前三天的纺锤体异常对着床前胚胎发育结局的影响（B）人胚胎前三天的染色体异常对着床前胚胎发育结局的影响（C）人胚胎不同阶段的染色体异常对子细胞细胞命运的影响

在分析染色体异常和人着床前胚胎停滞的关系的过程中，研究人员注意到人着床前胚胎晚期停滞与染色体异常无关。为了深入解析其中的机制，在广州慧眼大设施的支持下，研究人员通过在活细胞成像后对第五天成功成囊和停滞在桑椹胚的胚胎进行了高深度单胚胎蛋白组学分析，成功克服了靶向活细胞成像的局限性。基于微量蛋白组所提示的蛋白表达稳态失衡与内质网应激响应，研究人员才得以通过诱导内质网应激响应在分子和细胞层面完全重现桑椹胚阶段的停滞，至此阐明了人着床前胚胎晚期停滞的机制。

图9.（A）第五天成功成囊和停滞在桑葚胚的人胚胎差异蛋白分析（B）诱导内质网应激响应可以重现桑葚胚阶段的停滞

清华大学生物医学交叉研究院苏俊实验室2023级博士生李姿萱、中南大学/中信湘雅生殖与遗传专科医院副教授冷丽智、中国科学院动物研究所副研究员翟晶磊、国家蛋白质科学中心（北京）副研究员王晓文为论文共同第一作者；苏俊、林戈、徐小明、王红梅、杨云为论文共同通讯作者。

研究得到科技部国家重点研发项目、北京生命科学研究所内部经费、国家自然科学基金委项目、阿里巴巴达摩院青橙奖、中信集团重大科研项目、中国科学院先导项目、人体蛋白质组导航国际大科学计划（π-HuB计划）、“慧眼大设施工程”预研项目、北京市科技新星计划以及香港大学基础研究种子基金的资助，在北京生命科学研究所完成。