近日，Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了园艺学院王西平教授课题组的研究论文“A module with multiple transcription factors positively regulates powdery mildew resistance in grapevine”。该研究证实，转录因子VqWRKY46通过诱导更强的过敏性细胞坏死（HR）、积累更多的过氧化氢（H₂O₂）和胼胝质，并上调多种防御相关基因的表达，显著增强了葡萄对白粉病的抗性。进一步研究表明，VqWRKY46受到上游转录因子VqLIMYB的正调控，并能与转录因子VqNF-YC9互作，促进后者基因的表达。同时，VqWRKY46还可直接靶向抗性（R）基因VqDSC1并激活其转录；尽管VqNF-YC9本身无法结合VqDSC1，但其与VqWRKY46的互作增强了对VqDSC1的转录激活作用。该研究揭示了中国野生毛葡萄VqLIMYB-VqWRKY46/VqNF-YC9-VqDSC1信号模块调控白粉病抗性的分子机制，为葡萄抗病分子育种提供了新的理论基础。全文主要研究结果如下：

1.VqWRKY46是葡萄白粉病正调控因子

为明晰VqWRKY46在葡萄中的抗病功能，该研究借助农杆菌介导的体细胞胚转基因体系（Zhang et al., 2021），成功获得VqWRKY46稳定过表达株系（OE#4、OE#33）和干扰株系（RNAi#16、RNAi#32）（图1a）。接种葡萄白粉菌9 d后，与野生型（WT）相比，过表达植株表现出分生孢子数量减少、菌丝长度缩短，同时伴随胼胝质积累增加、过氧化氢（H₂O₂）含量升高及HR反应增强等现象（图1b-f），以及防御相关基因的表达水平显著上调（图1g）；而干扰植株的表型则呈现相反趋势（图1）。上述结果证实，VqWRKY46正向调控葡萄对白粉菌的抗性。

图1 VqWRKY46增强转基因葡萄对白粉病抗性

2.VqLIMYB直接结合VqWRKY46启动子上Myb motif（CAGTTA）并促进其表达

为探究VqWRKY46的上游调控机制，该研究通过酵母单杂交（Y1H）文库筛选，鉴定到转录因子VqLIMYB。生物信息学分析显示，VqWRKY46启动子区域存在MYB家族转录因子的典型结合基序（Myb motif: CAGTTA）。Y1H试验证实，VqLIMYB可特异性结合该启动子区域（图2a）。进一步的凝胶迁移实验（EMSA）表明，VqLIMYB与Myb motif元件的直接互作具有序列特异性（图2b）。双荧光素酶报告系统（DLR）及GUS活性检测结果显示，VqLIMYB可显著增强VqWRKY46启动子的转录活性（图2c-e）。上述结果表明，VqLIMYB通过直接结合VqWRKY46启动子上的Myb motif元件，激活其表达。通过瞬时转化技术获得VqLIMYB过表达和缺失转基因植株（OE-VqLIMYB、RNAi-VqLIMYB），接种白粉菌后的表型分析显示，VqLIMYB过表达显著增强葡萄对白粉病的抗性（图2f-h）。

图2 VqLIMYB结合VqWRKY46启动子上Myb motif并激活其转录

3.VqWRKY46与VqNF-YC9相互作用并促进VqNF-YC9的转录

为解析VqWRKY46的互作蛋白网络，该研究利用酵母双杂交（Y2H）文库筛选获得转录因子VqNF-YC9。通过Y2H验证、双分子荧光互补（BiFC）、分裂荧光素酶互补（Split-LUC）、Pull-down及荧光共振能量转移（FRET-AB）等试验，证实VqWRKY46与VqNF-YC9存在直接互作（图3）。此外还发现，VqWRKY46与VqNF-YC9均可通过自身互作形成同源二聚体。

图3 VqWRKY46与VqNF-YC9相互作用

进一步研究表明，VqNF-YC9启动子区域含有3种典型的WRKY结合基序W-box（Wbox1: TTGACC；Wbox2: TTGACT；Wbox3: TTGACA）。通过Y1H、EMSA及DLR试验，证实VqWRKY46可直接结合上述W-box元件并激活VqNF-YC9的转录（图4a-d）。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析显示，VqNF-YC9在VqWRKY46过表达株系（OE#4、OE#33）中的表达量显著高于野生型（WT），而在干扰株系（RNAi#16、RNAi#32）中表达量则呈下调趋势（图4e）。上述结果表明，VqWRKY46与VqNF-YC9之间存在双重调控关系：既能通过蛋白互作形成功能复合体，又能通过靶向启动子W-box元件调控VqNF-YC9的转录表达，进而构成多层次协同调控网络。通过瞬时转化获得VqNF-YC9过表达和缺失转基因植株（OE-VqNF-YC9、RNAi-VqNF-YC9），接种白粉菌后的表型分析表明，VqNF-YC9过表达可显著增强葡萄对白粉病的抗性（图4f, g）。

图4 VqWRKY46与VqNF-YC9的启动子上W-box元件结合并激活其表达

4.VqNF-YC9增强VqWRKY46对VqDSC1启动子的激活作用

为深入鉴定VqWRKY46的直接靶基因，该研究采用DNA亲和纯化测序技术（DAP-seq）进行分析，共鉴定到416个重叠结合峰，其中约28%定位于启动子区域。基序富集分析显示，核心顺式元件为典型W-box（TTGACC/T）（图5a-c）。重点关注到抗病基因VqDSC1，其启动子区域含有3个Wbox1（TTGACC）和4个NF-YC类转录因子结合位点CCAAT。通过Y1H、EMSA及DLR试验，证实VqWRKY46可特异性结合Wbox1并激活VqDSC1转录；而VqNF-YC9虽无法直接结合CCAAT位点，但与VqWRKY46互作后可显著增强其对VqDSC1启动子的激活作用（图5d-g）。RT-qPCR结果显示，VqDSC1在VqWRKY46过表达株系（OE#4、OE#33）中显著上调，在干扰株系（RNAi#16、RNAi#32）中显著下调，且其表达受白粉菌诱导显著增强（图5h-i）。功能验证表明，瞬时过表达VqDSC1（OE-VqDSC1）可诱导超敏反应（HR）并增强葡萄白粉病抗性，而干扰株系（RNAi-VqDSC1）则表现出感病表型（图5j-k）。综上，该研究揭示VqWRKY46与VqNF-YC9通过形成同源二聚体及蛋白复合体的双重机制，协同调控VqDSC1的表达，进而介导葡萄白粉病抗性。研究最终阐明了VqLIMYB-VqWRKY46/VqNF-YC9-VqDSC1信号模块的抗病调控网络（图6），为葡萄抗病分子育种提供了关键基因靶点及理论支撑。

图5. VqNF-YC9协同VqWRKY46激活抗性基因VqDSC1的转录调控

图6 VqLIMYB-VqWRKY46/VqNF-YC9-VqDSC1信号模块调控葡萄抗白粉病的分子机制

园艺学院已毕业博士研究生张修铭（现任职于宁夏大学葡萄酒与园艺学院）、张祺涵、朱彦勋为论文共同第一作者，王西平教授与美国马里兰大学Hua Lu教授为共同通讯作者。该研究受国家自然科学基金面上项目（32272693、31872071）及陕西省自然科学基础研究计划项目（2025JC-QYCX-023）资助。