组胺（Histamine，HA）是一种重要的单胺类信号分子，存在于中枢神经系统和外周组织，广泛地参与免疫、消化和神经信号调控。抗组胺药物常被用来缓解过敏反应。然而，抗组胺药物的一大副作用是嗜睡，这引起了科学家对组胺在中枢系统中的功能的关注。在大脑中，组胺能神经元的胞体主要分布于下丘脑结节乳头体核（Tuberomammillary nucleus, TMN），其神经纤维向全脑广泛投射；组胺能信号参与睡眠觉醒、学习记忆和摄食等过程。目前，人们对组胺的生理功能及作用机制仍有很多未知，其中一个重要的原因是缺乏灵敏、特异的工具，用于对组胺进行高时空分辨率的监测。

2023年3月15日，北京大学李毓龙教授实验室在Neuron杂志在线发表了题为“Genetically encoded sensors for measuring histamine release both in vitro and in vivo”的研究论文，报道了新型基因编码的组胺探针GRAB_HA的开发，以及结合新工具对睡眠觉醒过程中的组胺动态调控的研究。

论文截图

在这项工作中，李毓龙实验室首先灵活运用GRAB策略（GPCR-Activation Based Sensor）将循环重排的绿色荧光蛋白cpEGFP嫁接到四种人源组胺GPCR受体的第三个胞内环，发现基于H₄R的探针表现出优于其他受体的细胞膜定位特性，后续通过一系列优化，获得了基于H₄R的组胺荧光探针GRAB_HA1h（简称HA1h）。在HEK293T细胞表达的HA1h探针对组胺有~370%的荧光信号响应（ΔF/F₀）和~17 nM的亲和力（EC₅₀）（图1）。为了进一步拓展探针对组胺浓度的检测范围，作者筛选了来自于不同物种的组胺受体，并开发了基于水熊虫H₁R的组胺荧光探针GRAB_HA1m（简称HA1m），HA1m探针对组胺的最大ΔF/F₀~590%，EC₅₀ ~380 nM。HA1h和HA1m探针能在亚秒级（~0.3-0.6 s）时间尺度上响应胞外组胺浓度变化，且不与GPCR下游胞内信号偶联；进一步研究发现HA1h和HA1m探针只会响应组胺，而对组胺的前体、组胺代谢产物和其它神经递质均不响应，并且组胺引发的信号能够被相应受体的拮抗剂阻断，这说明探针保留了相应受体的药理学特性。

图1：新型组胺探针的刻画。A. 组胺探针工作原理。B. 组胺探针HA1h、HA1m和HA1mut在HEK293T细胞上的表达及对组胺的反应。C. 组胺探针对饱和浓度组胺的响应曲线。D. 组胺探针HA1h和HA1m对不同浓度组胺的信号响应

组胺探针是否能够检测内源组胺的释放？作者借助AAV病毒将HA1m探针表达在小鼠的前额叶皮层（Prefrontal cortex, PFC），制备急性脑切片后使用双光子成像成功地记录到了电刺激引起的组胺秒级释放。此外，作者还实时地观察到组胺信号从刺激位置向外的扩散。因此，HA1m组胺探针可以实现对内源组胺释放的高时空分辨率检测。

组胺探针是否能够应用于活体动物中？组胺是调控睡眠觉醒的重要分子，视前区（Preoptic area, POA）是参与睡眠觉醒调控重要的脑区，且接收组胺能神经元密集的投射。作者首先利用AAV病毒将HA1m探针表达在小鼠的视前区，通过光纤记录探针的荧光信号，同时记录小鼠脑电和肌电以判断睡眠状态。作者发现在小鼠快速眼动（REM）睡眠向觉醒转换和非快速眼动（NREM）睡眠向觉醒转换过程中组胺信号升高，在觉醒向NREM睡眠转换和NREM睡眠向REM睡眠转换过程中组胺信号下降。作为对照，利用突变失活型探针观察不到明显的信号变化，说明信号检测的特异性。进一步地，作者在组胺合成酶敲除（HDCKO）的小鼠中发现HA1m探针信号也没有明显变化。综上所述，HA1m探针能够实现在活体小鼠中对组胺动态变化进行可靠的、特异的、实时的检测。

图2：不同核团组胺动态变化动力学在睡眠时相转换过程中存在差异。A. 探针表达和记录示意图。B. HA1h探针在PFC和POA的动态变化曲线

组胺能神经元胞体位于下丘脑结节乳头体核，并向全脑发出广泛投射。那么，组胺在不同脑区的动态变化模式是否一致？作者将HA1h探针表达在小鼠的视前区和前额叶皮层，同时记录了这两个脑区的组胺在睡眠觉醒中的动态变化（图2）。结果发现，两个脑区组胺探针信号大小在相同睡眠时相时是一致的。有趣的是，在REM睡眠向觉醒转换、NREM睡眠向觉醒转换和觉醒向NREM睡眠转换过程中，视前区的组胺变化动力学比前额叶皮层更快，这提示了组胺在不同脑区中存在不同的调控模式。总之，利用新开发的组胺探针，作者发现不同脑区的组胺动力学存在差异，为研究组胺的功能提供了重要的启示。

在中枢神经系统中，除了本项工作研究的睡眠觉醒调控外，组胺还参与其它的生理和病理过程，包括摄食、运动、认知、癫痫和偏头痛等。在外周系统中，组胺还参与过敏反应、瘙痒和胃酸分泌等过程。新型的组胺荧光探针将会成为研究组胺参与的功能和其调控机制的有力工具。

组胺荧光探针GRAB_HA的工作原理及离体和在体应用

北京大学生命科学学院博士后董辉和博士生李梦尧（已毕业）为本文共同第一作者，李毓龙为通讯作者，实验室成员鄢羽岐、钱统瑞、林云致、刘灿、李国川和王欢对文章作出了重要贡献。该工作得到了阿姆斯特丹自由大学（Vrije Universiteit Amsterdam）Rob Leurs教授及其团队Xiaoyuan Ma和Henry F. Vischer的通力合作，以及浙江中医药大学/浙江大学陈忠教授团队和复旦大学中山医院杨向东教授团队的大力支持。该工作得到了北京大学膜生物学国家重点实验室、北大-清华生命科学联合中心、国家自然科学基金、北京市科委、生命医学峰基金和宋晨枫与高欣欣公益基金会等机构、经费和项目的大力支持。