近日，上海交通大学农业与生物学院刘振华课题组在Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America（PNAS）期刊上发表题为”Plastid 2-Oxoglutarate-dependent Dioxygenases Mediate Stereoselective C14β-Hydroxylation in Cardenolide Biosynthesis“的研究论文。本研究以夹竹桃科植物杠柳（Periploca sepium）为研究对象，首次在植物中发现α-酮戊二酸依赖型双氧化酶介导强心苷生物合成中立体特异性的C14β羟基化反应，为革新强心苷的合成策略奠定了至关重要的酶学基础。

强心苷是治疗心力衰竭的特效天然药物，其标志性结构特征之一，是甾体母核C14位连接有一个β构型的羟基。然而，在天然的甾体前体中，该位置却是一个α构型的氢原子。如何高效、精准地引入C14β羟基，一直是化学全合成及化学酶法合成面临的关键瓶颈。

本研究通过多组学关联分析，首先挖掘到催化强心苷前体孕烯醇酮合成的甾醇侧链裂解酶PsCYP87N10。随后，通过与PsCYP87N10的基因表达关联分析，挖掘出20个潜在的甾体羟基化候选酶，包括13个细胞色素P450酶（CYP）和7个α-酮戊二酸依赖型双加氧酶（2OGD）。利用烟草瞬时表达与原核表达体外酶活验证，发现其中一个候选酶Ps2OGD4具有孕烯醇酮羟基化活性。关键的核磁共振（NMR）与单晶衍射分析最终证实，该酶的产物正是14β-羟基孕烯醇酮，从而确证了其全新的C14β羟基化功能，该酶被重新命名为Ps14βPH。进一步的同位素示踪与植物体内基因沉默实验，证实了Ps14βPH直接参与杠柳中强心苷的生物合成途径。

本研究发现，催化强心苷合成起始（侧链裂解）的PsCYP87N10与催化关键步骤（C14β羟基化）的Ps14βPH，在杠柳基因组中存在共线性及紧密连锁的现象，提示它们可能被协同调控。此外，Ps14βPH含有一段该植物科所特有的质体定位肽，可能引导其进入富含辅因子的植物质体中进行高效反应。系统发育分析显示，杠柳中的PsCYP87N10与之前在其他植物中报道的同类酶（CYP87A亚家族）分属不同进化分支。这些证据共同表明，夹竹桃科植物可能独立进化出了一套全新的酶学工具箱，专门用于合成强心苷这类复杂分子。

该项研究首次鉴定并表征了一类独特的2-酮戊二酸依赖型双加氧酶（2OGD），它能够特异性催化强心苷生物合成中”卡脖子”的C14β羟基化反应。这项发现不仅为理解植物如何进化出复杂特化代谢途径提供了范例，更重要的是，为未来通过合成生物学策略，实现高价值强心苷药物的绿色、高效生物制造，提供了强大且创新的”酶学武器”。

上海交通大学刘振华课题组博士研究生王建华、周玄和助理研究员姬文娟为论文共同第一作者，上海交通大学农业与生物学院、张江高等研究院长聘教轨副教授刘振华为本文通讯作者。上海交通大学刘振华课题组成员卞江虎、张昌建、周弘、单长衡、安宁、黎容池也参与了本项工作，上海交通大学药学院长聘教轨副教授侯四化和博士后李权哲为本研究的X射线单晶衍射分析提供了重要技术支持。本研究得到国家自然科学基金的资助。